红鳍笛鲷调控体色视蛋白基因的时空表达模式研究

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红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)隶属于鲈形目笛鲷科笛鲷属,为暖水性中下层鱼类。主要分布于印度西太平洋及我国的南海和台湾海域还有广西、广东等沿海地区,是一种重要的海洋经济鱼类。视蛋白表达水平的变化可能是一种自我调节机制,使色素细胞保持对外界光照条件的敏感性,进而调节色素颗粒的聚集或扩散,最终改变体色。对红鳍笛鲷视蛋白的鉴定和表达分析有助于确定其在调节皮肤色素沉着中的功能作用,可为笛鲷属鱼类视蛋白对于体色调节的作用机制研究提供参考。本研究基于红鳍笛鲷基因组和转录组数据,通过对红鳍笛鲷视蛋白基因家族进行系统分析;对红鳍笛鲷早期色素细胞发育及体色的形成进行连续观察,并对色素形成重要时期进行转录组数据分析;以及利用实时荧光定量技术(RTqPCR)将红鳍笛鲷调控体色视蛋白基因与色素形成相关基因相结合,从不同组织及不同发育时期的表达研究来阐明视蛋白基因与色素相关基因的时空表达模式。主要结果如下:1.红鳍笛鲷的视蛋白基因家族分析结果显示,红鳍笛鲷基因组共有32个视蛋白基因,这些基因长度在1.1-86.2 kb,分布在15条染色体上。聚类分析表明红鳍笛鲷的sws2比斑马鱼多了2个拷贝。保守结构域和保守基序(motif)分析表明,32个视蛋白的序列均具有七个跨膜受体(7tm)保守结构域,红鳍笛鲷视蛋白家族包含10种共有motif。利用红鳍笛鲷血液、肝脏、肠、肌肉、红皮肤、黑皮肤,心脏、视网膜及脑9个组织转录组数据库对视蛋白基因的表达水平进行分析。结果表明,opn7a和opn7b基因分别在肠和红色皮肤上有特异性组织表达,sws2.1在红色皮肤中的表达量仅次于视网膜,tmt3a在红色皮肤的表达量高于视网膜组织,低于脑组织。其余视蛋白基因均在视网膜或者脑中高表达,而在其他组织中几乎没有表达。发生扩张的sws2基因的RT-qPCR结果显示,只有sws2.1在成鱼皮肤和脑组织中有表达,sws2.2、sws2.3均在视网膜中有较高表达。sws2.1在早期发育时期中的3 dph、15 dph、20 dph有表达,sws2.2在3 dph、45 dph黑皮中有表达,而sws2.3没有表达。红鳍笛鲷sws2基因在早期具有不同的表达模式,说明基因可能发生了功能分化,其中sws2.1可能侧重于非视觉功能。可能由于红鳍笛鲷成鱼和幼鱼栖息环境不同,在浅水层区域生活的幼鱼对紫外线敏感的视觉有强烈需求,所以在早期发育时期的1 dph、3 dph、10 dph检测到sws1和rh2.1的表达,而它们在成鱼组织中并未表达。通过RT-qPCR对13个中高表达基因进行验证,证实了RNA-Seq数据的可靠性。2.对红鳍笛鲷早期发育时期(胚胎至60日龄幼鱼)进行连续的色素细胞发育及体色形成观察,并且对色素细胞形成重要时期进行转录组数据分析。结果得出,红鳍笛鲷色素细胞出现的先后顺序依次为:黑色素细胞(晶体期)、黄色素细胞(1日龄)、虹彩色素细胞(10日龄)、红色素细胞(27日龄)。在整个观察过程中,随着各色素细胞的数量增加,颜色沉积,红鳍笛鲷体色一直加深,24日龄在尾柄处形成了一个黑色斑点,头部上方至嘴部形成一条黑斑,60日龄鱼体开始有退黑的现象。转录组分析显示,9个色素相关基因(scarb1、csf1、pax3、pax7.1、pax7.2、sox9b、tyr1、tyr2、tyrp1)在各色素细胞形成重要时期与上一时期的对比组中差异表达。一些差异表达基因的GO和KEGG富集到的功能通路包括糖酵解、氧化磷酸化、脂质转运体活性、细胞粘附分子功能等。3.成鱼组织RT–qPCR分析结果显示,体色调控视蛋白基因:opn7a、opn7b、tmt3a、sws2.1;红色素细胞相关基因:scarb1;黄色素细胞相关基因:csf1、pax3、pax7.1、pax7.2、sox9b及黑色素形成相关基因:tyr1、tyr2在成鱼黑皮或红皮中均有表达。表明它们可能共同发挥着调节身体色素沉着方面的功能性作用。早期发育过程RT-qPCR分析发现,opn7b从多细胞期至胚孔封闭期表达量逐渐下降,而后与tmt3a、sws2.1一样,在3日龄开始有较高水平表达,sws2.1在之后的15日龄表达水平达到最高。3日龄红鳍笛鲷仔鱼开始从外部摄取食物,游泳力和视觉能力都在慢慢增强,日间活动在浅水区域,视蛋白基因在3日龄高表达可能是对紫外线防护需求的体现。opn7基因发生了功能分化,在整个早期发育过程中没有检测到opn7a的表达。所有色素相关基因在早期发育过程中均有表达波动,这可能与调节胚胎色素细胞发育以及满足各种生理行为的需求相关。
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