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石房蛤毒素(Saxitoxin, STX)是目前已知毒性最强的海洋生物毒素之一，致死率极高。研究者们1932年开始对STX进行研究，但目前并无针对STX有效的防治措施。常见的检测方法存在重现性差、操作繁琐且成本高、耗时长等问题。一种既具有高亲和力及特异性优点，又容易大量化学合成，且易于修饰和固定在载体表面的新型分子识别元件——核酸适配体的出现，给石房蛤毒素的检测及防治带来新的契机。核酸适配体在分析检测、临床诊断和疾病治疗等方面均具有广泛应用。尽管过去几十年中报道过大量旨在优化和加速适配体筛选的技术，但目前仍缺乏简单且高效的筛选方法，尤其是针对STX这类分子量极小且没有易于修饰、固定和被识别基团的小分子靶标。
本研究首次尝试将一种在蛋白质纯化中已证实为简单高效的技术，引入核酸适配体筛选，命名为固定金属螯合——指数富集的配体系统进化技术(Immobilized metal chelate-systematicevolution ofligands byexponentialenrichment,IMC-SELEX)，并与已报道的捕获——指数富集的配体系统进化技术(Capture SELEX)平行筛选STX核酸适配体。然后通过分子对接和动力学模拟，对筛选获得的适配体与STX的结合机制进行分析，优化得到2条适配体，构建适配体传感器，并表征传感器在STX检测中的性能与主要参数。此外，本研究通过重组表达单链核苷酸环化酶构建环状单链DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)适配体，在小鼠体内对环状适配体的生物活性进行初步探索。主要研究内容及结果如下：
1、固定文库法筛选STX核酸适配体及初步鉴定亲和力。一种在蛋白质纯化中已证实为简单高效的技术，首次被引入核酸适配体的筛选，即IMC-SELEX。基于镍-次氮基三乙酸(Nickle-chargednitrilotriaceticacid, Ni-NTA)柱对ssDNA高效的吸附能力，筛选文库被固定，STX与ssDNA混合孵育后，通过离心就可分离结合靶标的ssDNA与游离ssDNA。仅进行6轮筛选，分别从随机ssDNA文库和G-四链体ssDNA文库中得到STX较高亲和力适配体STX-R-75和STX-G4-45，与STX的亲和力Kd值分别为210nM和42.6nM。IMC-SELEX法固定ssDNA文库可以有效避免因固定靶分子而影响靶分子天然构象的问题，相比固定STX法(10轮筛选)和氧化石墨烯法(9轮筛选)，IMC-SELEX法筛选效率显著提高(6轮筛选)且操作简单，为靶分子尤其是小分子核酸适配体的筛选拓展了新的途径。此外，本研究尝试在不加入T4DNA连接酶的条件下，利用捕获SELEX(Capture SELEX)法构建环状ssDNA文库，让文库在环状结构基础上与STX相互作用，从而避免后期对线性核酸适配体进行环化等优化可能造成的结构影响。经过12轮筛选，得到一条STX高亲和力适配体73，与STX的亲和力Kd值为55.7nM。证实利用CaptureSELEX法构建环状ssDNA文库进行靶标适配体筛选的可行性。
2、STX核酸适配体的优化及结合机制分析。参考NUPACK软件对适配体二级结构的预测结果，将三条核酸适配体的引物和部分发夹结构区进行截短，分别获得核心序列45e、73a和75a，与STX的亲和力Kd值分别为21.2nM，23.6nM和136nM，且三条适配体均与STX特异性结合。然后通过分子对接和分子动力学模拟，分析亲和力更高的适配体45e和73a与STX的结合机制。模拟结果显示靶标STX主要通过氢键、范德华力和静电作用力结合在适配体顶端，45e-STX和73a-STX的结合自由能分别为-23.38kcal/mol和-20.44kcal/mol。以上结果合理地解释了两条适配体45e和73a均能与STX高亲和力稳定结合的原因。进一步优化得到适配体45e-1(Kd=19nM)和73a-1(Kd=21.4nM)，有望作为STX的分子识别元件应用于后续深入研究。
3、STX核酸适配体传感器的制备与应用。基于分析分子间相互作用的生物膜干涉技术(Biolayer interferometry, BLI)，以适配体45e-1和73a-1作为分子识别元件，制备两个STX适配体生物传感器，均可在10min完成STX的检测分析，且操作相对简单。而传统的亲水作用液相色谱-质谱联用技术(Hydrophilic interaction liquid chromatographycoupled tomassspectrometry,HILIC-MS)检测需要20min且需要专业的操作人员，酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)则需要至少1h，操作繁琐且易出现交叉反应。此外，这两个适配体传感器检测限均为0.5ng/mL，显著低于国内外卫生组织规定的STX安全标准(3 ng/mL)，且不与其他类似毒素产生交叉反应。在对海水中不同浓度STX进行检测时，回收率和变异系数值均处于正常范围。表明基于两条适配体构建的适配体传感器均具有良好的稳定性和重复性，且可以实现STX的快速检测分析，有应用于检测复杂系统中STX的潜力。
4、构建STX环状核酸适配体并进行生物活性探索。尝试利用重组表达的环化酶制备可以抵抗ExoⅠ降解的环状ssDNA适配体。首先通过BLI和ELISA实验验证环状适配体与STX结合的亲和力在环化后有一定程度提高，尤其是从环状ssDNA文库中得到的适配体73a-1，亲和力提高1.6倍。然后在小鼠体内证实环状适配体本身对小鼠没有明显毒性。纯化后的环状适配体与STX混合孵育后注射入小鼠体内，小鼠平均死亡时间延长1倍，与线性适配体相比具有显著差异，表明环状适配体可显著延长小鼠死亡时间。这一结果展示出通过环化酶环化增加适配体稳定性的良好前景，为后续适配体的深入研究拓展了新的思路。
综上所述，本研究引入新的筛选方法，并设计可形成特殊结构的筛选文库，尝试用新的简单高效的IMC-SELEX法和已报道的CaptureSELEX法固定文库，从2个G-四链体文库中分别筛选获得2条STX适配体。对适配体与STX的结合机制进行分析后，优化得到2条高亲和力及特异性适配体，构建适配体传感器，实现在复杂样品中对STX进行快速检测分析。此外，尝试用重组表达的环化酶构建环状ssDNA适配体，在小鼠体内证实环状适配体可显著延长小鼠死亡时间。本研究为其他靶分子尤其是小分子适配体的筛选、鉴定和后续深入研究奠定良好的基础，开辟有前景的新途径。
本研究首次尝试将一种在蛋白质纯化中已证实为简单高效的技术，引入核酸适配体筛选，命名为固定金属螯合——指数富集的配体系统进化技术(Immobilized metal chelate-systematicevolution ofligands byexponentialenrichment,IMC-SELEX)，并与已报道的捕获——指数富集的配体系统进化技术(Capture SELEX)平行筛选STX核酸适配体。然后通过分子对接和动力学模拟，对筛选获得的适配体与STX的结合机制进行分析，优化得到2条适配体，构建适配体传感器，并表征传感器在STX检测中的性能与主要参数。此外，本研究通过重组表达单链核苷酸环化酶构建环状单链DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)适配体，在小鼠体内对环状适配体的生物活性进行初步探索。主要研究内容及结果如下：
1、固定文库法筛选STX核酸适配体及初步鉴定亲和力。一种在蛋白质纯化中已证实为简单高效的技术，首次被引入核酸适配体的筛选，即IMC-SELEX。基于镍-次氮基三乙酸(Nickle-chargednitrilotriaceticacid, Ni-NTA)柱对ssDNA高效的吸附能力，筛选文库被固定，STX与ssDNA混合孵育后，通过离心就可分离结合靶标的ssDNA与游离ssDNA。仅进行6轮筛选，分别从随机ssDNA文库和G-四链体ssDNA文库中得到STX较高亲和力适配体STX-R-75和STX-G4-45，与STX的亲和力Kd值分别为210nM和42.6nM。IMC-SELEX法固定ssDNA文库可以有效避免因固定靶分子而影响靶分子天然构象的问题，相比固定STX法(10轮筛选)和氧化石墨烯法(9轮筛选)，IMC-SELEX法筛选效率显著提高(6轮筛选)且操作简单，为靶分子尤其是小分子核酸适配体的筛选拓展了新的途径。此外，本研究尝试在不加入T4DNA连接酶的条件下，利用捕获SELEX(Capture SELEX)法构建环状ssDNA文库，让文库在环状结构基础上与STX相互作用，从而避免后期对线性核酸适配体进行环化等优化可能造成的结构影响。经过12轮筛选，得到一条STX高亲和力适配体73，与STX的亲和力Kd值为55.7nM。证实利用CaptureSELEX法构建环状ssDNA文库进行靶标适配体筛选的可行性。
2、STX核酸适配体的优化及结合机制分析。参考NUPACK软件对适配体二级结构的预测结果，将三条核酸适配体的引物和部分发夹结构区进行截短，分别获得核心序列45e、73a和75a，与STX的亲和力Kd值分别为21.2nM，23.6nM和136nM，且三条适配体均与STX特异性结合。然后通过分子对接和分子动力学模拟，分析亲和力更高的适配体45e和73a与STX的结合机制。模拟结果显示靶标STX主要通过氢键、范德华力和静电作用力结合在适配体顶端，45e-STX和73a-STX的结合自由能分别为-23.38kcal/mol和-20.44kcal/mol。以上结果合理地解释了两条适配体45e和73a均能与STX高亲和力稳定结合的原因。进一步优化得到适配体45e-1(Kd=19nM)和73a-1(Kd=21.4nM)，有望作为STX的分子识别元件应用于后续深入研究。
3、STX核酸适配体传感器的制备与应用。基于分析分子间相互作用的生物膜干涉技术(Biolayer interferometry, BLI)，以适配体45e-1和73a-1作为分子识别元件，制备两个STX适配体生物传感器，均可在10min完成STX的检测分析，且操作相对简单。而传统的亲水作用液相色谱-质谱联用技术(Hydrophilic interaction liquid chromatographycoupled tomassspectrometry,HILIC-MS)检测需要20min且需要专业的操作人员，酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)则需要至少1h，操作繁琐且易出现交叉反应。此外，这两个适配体传感器检测限均为0.5ng/mL，显著低于国内外卫生组织规定的STX安全标准(3 ng/mL)，且不与其他类似毒素产生交叉反应。在对海水中不同浓度STX进行检测时，回收率和变异系数值均处于正常范围。表明基于两条适配体构建的适配体传感器均具有良好的稳定性和重复性，且可以实现STX的快速检测分析，有应用于检测复杂系统中STX的潜力。
4、构建STX环状核酸适配体并进行生物活性探索。尝试利用重组表达的环化酶制备可以抵抗ExoⅠ降解的环状ssDNA适配体。首先通过BLI和ELISA实验验证环状适配体与STX结合的亲和力在环化后有一定程度提高，尤其是从环状ssDNA文库中得到的适配体73a-1，亲和力提高1.6倍。然后在小鼠体内证实环状适配体本身对小鼠没有明显毒性。纯化后的环状适配体与STX混合孵育后注射入小鼠体内，小鼠平均死亡时间延长1倍，与线性适配体相比具有显著差异，表明环状适配体可显著延长小鼠死亡时间。这一结果展示出通过环化酶环化增加适配体稳定性的良好前景，为后续适配体的深入研究拓展了新的思路。
综上所述，本研究引入新的筛选方法，并设计可形成特殊结构的筛选文库，尝试用新的简单高效的IMC-SELEX法和已报道的CaptureSELEX法固定文库，从2个G-四链体文库中分别筛选获得2条STX适配体。对适配体与STX的结合机制进行分析后，优化得到2条高亲和力及特异性适配体，构建适配体传感器，实现在复杂样品中对STX进行快速检测分析。此外，尝试用重组表达的环化酶构建环状ssDNA适配体，在小鼠体内证实环状适配体可显著延长小鼠死亡时间。本研究为其他靶分子尤其是小分子适配体的筛选、鉴定和后续深入研究奠定良好的基础，开辟有前景的新途径。