栉孔扇贝FTZ-F1、CYP17A1、CYP17A2基因的序列特征及表达分析

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孤儿核受体家族成员FTZ-F1是参与生物激素生成、性腺分化的重要转录调节因子基因。细胞色素P450家族成员CYP17A1、CYP17A2基因是类固醇激素合成通路上的关键限速酶。FTZ-F1基因与CYP17A1、CYP17A2基因的在脊椎动物中的研究已经比较广泛,但在软体动物中的研究还相对较少。
  栉孔扇贝(Chlamys farreri)是重要的经济贝种,本实验以栉孔扇贝为研究对象,对FTZ-F1、CYP17A1、CYP17A2三个基因序列进行了序列特征分析、多重序列比对、系统进化分析以及三维结构预测,检测了上述三个基因在栉孔扇贝雌雄个体不同组织中以及性腺发育周期中的表达,探索了表达规律和特征,推测了基因的功能,主要研究如下:
  1、FTZ-F1基因CDS长1668bp,编码555个氨基酸。氨基酸序列分析其含有DBD和LBD(LBD区域里含有一个激活功能域AF-2)保守区,蛋白三维结构预测也印证了上述两个保守区的存在,氨基酸多重序列比对结果显示栉孔扇贝FTZ-F1与其他物种保守区相似。系统进化分析显示栉孔扇贝FTZ-F1蛋白系统进化与物种分类地位基本一致。该家族基因可以命名为FTZ-F1、或NR5A亚家族、或SF-1亚家族,结合栉孔扇贝该基因的序列及表达模式,依据文献中其他不同物种FTZ-F1家族的分类和命名方式,将该基因命名为栉孔扇贝的FTZ-F1基因。
  半定量PCR检测FTZ-F1基因在组织中的表达显示,其在雌性个体的闭壳肌、肾和鳃组织中表达较强,在其他不同组织中有较弱表达,在雄性个体的精巢、闭壳肌、肾和鳃组织中表达较强,其他组织表达较弱,说明该基因的组织表达比较广泛,雌雄个体表达特征存在差异,具体原因有待进一步探究;分别取栉孔扇贝增殖期、生长期、成熟期的雌雄性腺组织,荧光定量PCR检测结果显示FTZ-F1主要在成熟期的精巢中表达,表达量显著高于其他时期性腺,推测与成熟期精巢中睾酮含量显著升高有一定的关系,印证了FTZ-F1参与栉孔扇贝的精巢发育,在成熟期精巢中发挥重要作用。
  2、CYP17A1和CYP17A2基因是CYP17家族成员,隶属于P450超家族,含有Ono序列、Ozols'十三肽区和亚铁血红素结合区三个保守区,其中Ono序列保守区是CYP17区别与其他P450家族基因而特有的。
  比较不同物种CYP17A1和CYP17A2的Ono保守区序列,确定了CYP17A1与CYP17A2的特有位点,对栉孔扇贝中的两个相关基因进行了归类。
  栉孔扇贝CYP17A1基因长1522bp,编码428个氨基酸,含CYP17家族的三个保守区。氨基酸多重序列比对显示该基因的保守区与其他物种一致。系统进化树显示,栉孔扇贝CYP17A1蛋白先与虾夷扇贝CYP17A1聚类,再与太平洋牡蛎CYP17A1以及海蜗牛CYP17A1聚类,最后与其他物种的CYP17A1蛋白聚类,显示出的系统进化关系与物种的分类地位基本一致。
  半定量PCR技术检测栉孔扇贝CYP17A1在不同组织中的表达发现,在雌性个体的肾和肝胰腺中表达较强,其他组织表达较弱,在雄性个体的肝胰腺中表达较强,其他组织表达较弱,表明CYP17A1基因在栉孔扇贝中具有广泛表达的特征,在不同的组织中都可能发挥生理功能;荧光定量PCR检测CYP17A1基因在性腺周期中的表达,结果显示:在卵巢发育过程中,CYP17A1在生长期表达量最高,增殖期和成熟期表达量较低,认为可能在卵母细胞的生长过程中发挥作用,推测可能是通过参与雌二醇的生成而影响卵母细胞的生长;在精巢发育过程中,该基因随着精巢发育表达量上升,推测该基因可能通过参与睾酮的生成而在扇贝精巢发育中发挥作用。
  栉孔扇贝CYP17A2基因长3600bp,编码503个氨基酸,同样含有CYP17家族的三个保守区。
  半定量PCR结果显示,CYP17A2在雌性个体的肾和鳃中表达量较高,其他组织表达量较弱,在雄性个体的闭壳肌、肾、鳃以及精巢中表达量较高,在其他组织中的表达量弱一些,鉴于该基因的表达研究目前仅在鱼类中可见,其在不同组织中功能尚不明确,还需要更多实验数据的支持;荧光定量PCR结果显示CYP17A2基因在卵巢的成熟期表达量最高,显著高于增殖期和生长期,推测该基因可能通过参与调节17α,20β-DP(17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one,DHP,一种孕激素)的产生,从而在卵母细胞的成熟过程中发挥作用,在精巢发育过程中,CYP17A2基因在成熟期表达量最高,显著高于增殖期和生长期,认为该基因可能通过参与孕激素的生成而对精子的排出以及精子的活力等产生影响。
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