海鞘来源的微生物的多样性与2株瘤海鞘共附生真菌次级代谢产物的研究

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海鞘由于独特滤食的特性,使其体内蕴藏大量的微生物,渐渐成为国内外学者研究海洋天然产物最多的海洋动物之一,从中分离微生物也成为获取和应用海洋微生物资源的一条重要途径。海鞘是海洋抗肿瘤先导化合物的重要来源,也是海洋微生物的良好来源。研究表明,海洋生物的生物活性化合物部分来自其附生微生物,这意味着海鞘的相关微生物研究有可能找到新的生物活性化学物质。本研究对采自福建漳州东山岛海域的几种海鞘共附生微生物通过纯培养的方式进行分离并对分离菌株进行了16S rRNA序列测定和种属归类。74株菌株经鉴定分为17个属,其中盐单胞菌(24)、铜绿假单胞菌(12)、弧菌(8)、希瓦氏菌(7)、摩根氏菌(4)、芽孢杆菌(3)、链霉菌(3)、葡萄球菌(2)、泛菌(2)、普罗维登斯菌(2)以及拟诺卡氏菌、兰奥尔菌、Glutamicibacter、肥杆菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、盐芽孢杆菌各一株。对其中一种星座短腹海鞘通过Illumina MiSeq高通量测序技术,分析了样品中共附生微生物的物种多样性和物种丰度信息。测序共获得37911条序列,310个OTU;稀释曲线表明测序深度足够;多样性指数Simpson值为0.373,Shannon值为2.494。样品共附生细菌分属于24个门,优势门有变形菌门(Proteobacteria,78.86%)、放线菌门(Actinobacteria,6.01%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,4.67%)、蓝藻门(Cyanobacteria,2.62%)、厚壁菌门(Firmicutes,1.79%)、柔膜菌门(Tenericutes,1.76%)、螺旋菌门(Spirochaetae,1.33%);分属于197个属,优势属有Ruegeria(60.83%)、SAR116clade科下未知属(3.27%)、Rhodococcus(2.40%)、Cyanobacteria纲下未知属(2.26%)、CandidatusHepatoplasma(1.76%)、PeM15目下未知属(1.61%)、Spirochaetaceae科下未分类属(1.33%)等10个。通过纯培养技术共分离获得15株可培养共附生菌,分属于8个属,分别为弧菌Vibrio(7株)、希瓦氏菌Shewanella(2株),以及Pseudomonas、Pseudovibrio、Thalassobius、Exiguobacterium、Flavobacterium、Thalassospira属各一株。分别对海鞘共附生真菌淡紫拟青霉FBZ-1和青霉BNG-1次级代谢产物进行研究。通过菌株发酵,得到提取物浸膏。运用薄层层析、正相硅胶柱、反相硅胶柱、HP-20大孔吸附树脂、MCI柱、Sephadex LH-20凝胶柱、Sephadex G-25凝胶柱和半制备型高效液相等色谱方法对提取物进行高效快速地分离纯化,结合现代波谱学手段(LC-TOF MS、1H-和13C-NMR、COSY、HSQC、HMBC、ROESY、UV等)和物理化学方法鉴定了其中29个结构,包括芳香胺、生物碱和二酮哌嗪类,分别为N-(2羟基苯乙基)乙酰胺,lumichrome,1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸,β-咔啉,环(异亮氨酸-脯氨酸),环(亮氨酸-羟基脯氨酸),环(色氨酸-缬氨酸),环(亮氨酸-脯氨酸),环(苯丙氨酸-脯氨酸),环(异亮氨酸-丙氨酸),环(色氨酸-亮氨酸),苯乙胺,N-乙酰苯乙胺,吲哚乙胺,N-甲基色胺,N-(4-羟基)丁酰苯乙胺,对羟基苯乙胺,5,7,4-三羟基异黄酮,7,4-二羟基异黄酮,7,3,4-三羟基异黄酮,邻苯二甲酸异辛酯,2,4-N,N-dimethyl-lumichrome,3,4-二氢-3-甲基-β-咔啉-1-酮,色氨酸,2-羟基-3-吲哚丙酸,环(缬氨酸-脯氨酸),环(亮氨酸-丙氨酸),环(苯丙氨酸-5-甲基-3,4-脱氢脯氨酸),环(色氨酸-天冬酰胺)。为了探索海鞘与其共附生生物之间代谢产物是否存在内在联系,通过对皱瘤海鞘与其共附生真菌FBZ-1次级代谢产物的比较研究发现,微生物与其宿主的化合物存在相似的类型,其中以芳香胺类、咔啉和吲哚类生物碱为主。研究表明皱瘤海鞘的化学成分一部分来源于共附生微生物。充分利用我国丰富的海鞘及其共附生微生物资源,研究其次级代谢产物结构多样性,发现其中可能含有的结构新颖的化学物质,开发具有我国自主知识产权的抗菌、抗病毒及抗肿瘤新药,具有十分重要的理论意义和潜在的应用价值。
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