研究背景：鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜上皮细胞的恶性肿瘤。它的发生、发展、临床表现及治疗都与其他头颈部肿瘤有明显的区别。全世界每年约有80,000例新发鼻咽癌患者,其中男女比例约为2.3：1。在中国南方及东南亚较为严重,尤其中国南方每年约有20/100,000新发病例报道。它是我国南部最常见的恶性肿瘤之一。鼻咽癌发病年龄曲线由20岁开始上升,至50-60岁的年龄组达最高。病理类型以低分化鳞癌为主。主要通过淋巴结转移至颈淋巴结,亦可通过血液转移至骨、肺、肝。放射治疗是其主要治疗手段。对于早、中期患者,放疗效果明显,5年生存率>80%。虽然早期放疗可以取得满意的效果,但随着病变的进展30%～40%患者出现远处转移和局部复发。而且早期发现困难,患者就诊时多有颈部淋巴结转移。在确诊的鼻咽癌患者中,约70%为Ⅲ～Ⅳ期预后较差。对于这些晚期鼻咽癌则只能采用化疗为主的综合治疗,放化疗相结合虽然可以缓解患者病情,但是在临床治疗中常出现对放化疗的抵抗性,并且毒副作用较重。整体治疗5年生存率在50%左右。因此需要我们继续研究鼻咽癌的发病机制,寻找更多更好治疗鼻咽癌的方法。大多数的肿瘤治疗是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来克服肿瘤的。凋亡是程序性细胞死亡的一种,即细胞在特定的内源和外缘信号转导下,依赖caspase参与,染色质凝聚和外周化、细胞质减少、核片段化与细胞质致密化,细胞皱缩分解成凋亡小体,被邻近细胞或巨噬细胞吞噬清除。近来发现,程序性细胞死亡的另一种形式——自噬也在肿瘤发生、发展中有着重要的主要。细胞自噬是不依赖caspase参与,以细胞内双层膜结构包裹变性坏死的细胞器或胞浆蛋白形成自噬小体,后被溶酶体分解清除。Bcl-2家族在凋亡过程中有着重要的作用。Bcl-2家族蛋白作为主要调控凋亡的蛋白,调控着细胞凋亡。近来有研究表明,凋亡与自噬相互作用,协同促进细胞死亡。有研究表明,Bcl-2过表达能够抑制自噬的发生。Bcl-2即能诱导凋亡,又能影响自噬的发生。Bcl-2引发的自噬可能与自噬相关基因Beclinl有关。Bcl-2蛋白能与Beclinl蛋白的BH3结构域结合,BH3的类似物能竞争性对抗Beclin1与Bcl-2之间的结合,能够使Beclinl释放出来促进自噬。因此研究靶向Bcl-2治疗,诱导肿瘤细胞发生凋亡与自噬,抑制肿瘤增殖,是一个值得研究的课题。Cleary等研究发现,EB病毒中有一个开放的阅读框架与Bcl-2基因有同源性,称作BHRF,它与Bcl-2相似,能够阻止人与鼠的淋巴细胞中由于生长因子缺乏引起的凋亡。EB病毒还能介导内源性Bcl-2的表达而发挥抑制细胞凋亡的作用,而后证实,该病毒含有额外的基因,能够间接地在细胞中引起Bcl-2的反转录表达,且利用Bcl-2阻止宿主细胞的凋亡。同样在Henderson和Sheng分别发现EB病毒潜伏感染期表达产物LNP1和BARF1能通过上调Bcl-2和MCL-1的水平来保护宿主细胞,阻止宿主细胞发生凋亡。Song等发现Bcl-2在鼻咽癌组织中的表达水平明显高于癌旁非癌组织和炎性组织。刘阳云等人研究发现在鼻咽癌中Bcl-2阳性表达率高达82%。因此靶向Bcl-2基因治疗鼻咽癌,同样有着重要的意义。棉酚(gossypol)是一种从于棉花的茎、叶、种子与根部提取黄色多酚羟基双萘醛类化合物。棉酚在医药领域最初以醋酸棉酚作为男性避孕药临床应用多年,近来研究表明其作为一种新型Bcl-2的小分子阻断剂,在多种肿瘤中表现出明显的抗肿瘤活性。Apogossyplone (ApoG2)是去除两个醛基后合成的一种新型棉酚衍生物,不但毒性低,副作用小,而且也对多种肿瘤抑制效果明显,显示出了更好的应用前景。研究目的：本实验以高表达Bcl-2的鼻咽癌细胞株CNE-2为研究对象,研究ApoG2对鼻咽癌细胞系CNE-2细胞的体外、体内生长抑制作用,诱导细胞发生凋亡与自噬现象并初步探讨其可能的作用机制,同时观察ApoG2对人鼻咽癌细胞系CNE-2细胞放射治疗增敏作用,协同诱导发生凋亡与自噬现象及探讨其可能作用机制。为ApoG2的进一步研究与临床应用提供实验依据,并奠定理论基础。实验方法：1.CCK-8体外增殖法研究ApoG2单药作用24h、48h和72h对鼻咽癌细胞系CNE-2细胞的体外增殖抑制作用计算IC50值；2.CCK-8体外增殖法研究ApoG2联合放射治疗作用48h对鼻咽癌细胞系CNE-2体外增增殖抑制作用；3. Hoechst33258荧光染色法观察ApoG2单药及联合放射治疗作用于鼻咽癌细胞系CNE-2后引起的凋亡形态变化；4.吖啶橙荧光染色法观察ApoG2单药及联合放射治疗作用于鼻咽癌细胞系CNE-2后引起的自噬形态变化；5.透射电镜观察ApoG2作用于鼻咽癌细胞系CNE-2引起的细胞超微结构的形态学变化情况；6.流式细胞仪检测ApoG2单药及联合放射治疗作用于鼻咽癌细胞系CNE-2细胞后引起的细胞凋亡率及细胞自噬率的变化情况；7. Western blot实验检测ApoG2单药及联合放射治疗作用于鼻咽癌细胞系CNE-2细胞后Bcl-2蛋白及Beclin1蛋白表达变化；8.复制CNE-2鼻咽癌裸鼠模型观察ApoG2体内抑制肿瘤生长情况。实验结果：1.通过CCK-8法体外增殖实验检测显示浓度分别5、10、20、40、60和80μmol/L的ApoG2作用于人鼻咽癌CNE-2细胞24h、48h和72h后,均可见对细胞具有生长抑制作用,且具有剂量-时间依赖性。不同时间点的抑制率差异比较有统计学意义(F=1819.354,P=0.000),作用时间越长,ApoG2对细胞的抑制效应越明显；不同浓度的抑制率差异比较亦有统计学意义(F=2041.671,P=0.000),作用浓度越大,ApoG2对细胞的抑制效应越强。同时浓度与时间之间存在交互效应(F=202.540,P=0.000)。时间的延长和浓度的增加,ApoG2对人鼻咽癌CNE-2细胞的抑制率升高。计算ApoG2在作用72h对CNE-2细胞的IC50值为23.61μmol/L。ApoG2联合放射治疗作用CNE-2细胞48h,可看出不同放射剂量间比较具有显著性差异(F=2726.28, P=0.000), ApoG2在不同药物浓度间比较亦具有显著性差异(F=4316.28,P=0.000)。两者之间存在交互效应(F=18.54,P=0.000)。2. Hoechst33258荧光染色法显示,ApoG2单药及联合放射治疗作用于人鼻咽癌CNE-2细胞48h,镜下观察到对照组细胞染色质均匀,淡蓝色的核形态规则的正常细胞核。ApoG2单药及联合放射治疗组均可见明显核固缩、碎裂,染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡特征,联合放射治疗治疗组发现凋亡现象更加明显。3.吖啶橙荧光染色法观察,ApoG2单药及联合放射治疗作用于人鼻咽癌CNE-2细胞48h,对照组细胞的胞核与胞质呈亮绿色荧光,ApoG2及联合放射治疗组胞质或胞核中酸性自噬泡被染成亮红色荧光,联合放射治疗作用组自噬现象更明显。4.透射电镜检测可观察到,ApoG2作用于人鼻咽癌CNE-2细胞48h,对照组的人鼻咽癌CNE-2细胞形态良好,药物组(ApoG240μmol/L)的CNE-2细胞体内大空泡增多,多个散在的膜性双层结构等细自体吞噬现象。5.Flow cytometry (FCM)检测凋亡率显示,ApoG2单药及联合放射治疗作用于人鼻咽癌CNE-2细胞48h,对照组凋亡率为(3.90±0.34)%,ApoG2(40μmol/L)组为(19.52±1.18)%,差异有统计学意义(F=485.294,P=0.000)；对照组、ApoG2(20μmol/L)单药组、单纯放射治疗组及联合放射治疗组比较,凋亡率组间均数差异具有统计学意义(F=149.511,P=0.000),联合作用组与其他三组比较差异均具有统计学意义(P<0.05),两药联合凋亡率更高。6.FCM检测白噬荧光强度显示,自噬荧光强度为对照组(0.92±0.31)%,ApoG2(40μmol/L)组为(28.24±7.35)%,差异有统计学意义(F=41.354,P=0.003),ApoG2组高于对照组。7. Western blot检测结果显示40μmol/L的ApoG2作用后人鼻咽癌CNE-2细胞后,Bcl-2蛋白的表达量较对照组降低,与对照组相比差异具有统计学意义(F=68.909, P=0.001); Beclinl蛋白表达量较对照组增加,与对照组相比差异具有统计学意义(F=497.906,P=0.000)。在联合放射治疗实验中,Bcl-2蛋白相对表达量,组间均数差异具有统计学意义(F=69.248,P=0.000),联合作用组与其他三组比较差异具有统计学意义(P<0.05),联合组Bcl-2蛋白的表达量更低。Beclinl蛋白相对表达量,组间均数差异具有统计学意义(F=111.591,P=0.000),联合作用组与其他三组比较差异均具有统计学意义(P<0.05),联合组Beclinl蛋白的表达量更高。8.体内移植瘤实验可观察到,当注射药物第12天时终止实验,剥离肿瘤,称量肿瘤重量后,计算肿瘤抑制率为65.49%,与对照组比较,治疗后肿瘤体重有明显差异,P<0.05。整个实验期间,未观察裸鼠有明显不良反应。按照评价标准：肿瘤生长抑制率<40%,为无效；肿瘤生长抑制率≥40%,且P<0.05为有效。我们认为ApoG2能明显抑制人鼻咽癌CNE-2细胞体内增殖。实验结论：ApoG2在体内外可以抑制人鼻咽癌细系CNE-2细胞增殖并诱导细胞凋亡与自噬发生程序性细胞死亡。ApoG2还能增加人鼻咽癌细系CNE-2细胞对放射治疗的敏感性,增加细胞凋亡与自噬现象发生,协同抑制肿瘤细胞增殖。其机制可能与药物作用于Bcl-2基因,引起Bcl-2表达下调,诱导Bcl-2途径细胞凋亡,同时Bcl-2蛋白表达下降,间接减少Bcl-2蛋白与Beclinl蛋白结合的机会,能够使Beclinl蛋白释放出来,从而促进细胞自噬的发生,协同抑制肿瘤的生长、增殖。