论文部分内容阅读
背景胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。中国胃癌的发病率持续上升,每年新发患病人数占全球患病总数近50%,且大部分病例得到确诊时已处于局部进展期,总体预后不良。在肿瘤的形成过程中,癌基因和抑癌基因相互作用,其复杂的作用机制需要我们不断地去探索。SIRT1(Sirtuin-1)是烟酰胺依赖的III类组蛋白去乙酰化酶,它可通过对组蛋白,非组蛋白和DNA甲基化调控细胞生理和病理过程,其在肿瘤形成过程中扮演着双重角色。在胃癌发生发展过程中,研究报道其扮演一种肿瘤抑制因子角色。且有研究称SIRT1通过NF-kB/Cyclin D1信号通路诱导G1期静止从而抑制胃癌细胞的增殖,提示其可通过改变细胞周期从而影响胃癌的发生发展。miRNA是一类短链非编码RNA,其可通过结合到靶基因的3’-UTR(3’untranslated regions,3’非翻译区)抑制靶基因的表达或者促进靶基因的降解。大量的研究结果表明miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要的生物学功能。我们通过TCGA数据库筛选出差异表达的miRNA,并且选择了差异表达比较显著的miR-1301作为我们的研究靶点。之前的一项研究已经表明miR-1301-3p能够抑制肝癌细胞HepG2的迁移和侵袭,然而在随后的一项研究中,miR-1301-3p被认为在肝癌细胞中高表达,并且其能促进肝癌的发生发展,前后相矛盾的结果使得miR-1301-3p的功能更加神秘。之后有研究发现,miR-1301-3p还能够通过靶向调控PPP2R2C促进前列腺癌细胞的增殖。在胶质瘤中,有研究称其可通过作用于N-Ras抑制胶质瘤细胞的增殖。除此之外,miR-1301可通过特异性的p53依赖的方式抑制特定肿瘤细胞的迁移与侵袭。然而,miR-1301-3p在胃癌中所发挥的作用尚不清楚。目的明确miR-1301-3p在胃癌组织和细胞中的表达,探讨miR-1301-3p对胃癌细胞增殖功能的影响及相关分子机制,识别miR-1301-3p下游作用的靶基因,阐述miR-1301-3p/SIRT1在胃癌细胞增殖中发挥的作用,探索miR-1301-3p可能的作用机制,为发现新的血清生物标记物、提高胃癌的早期诊断以及靶向治疗提供新思路。方法1.在60对人类胃癌组织及癌旁组织中检测miR-1301-3p和SIRT1的表达量,并将miR-1301-3p相对表达量与临床病理资料进行关联性分析。2.在SGC-7901和MGC-803细胞系中,通过慢病毒载体分别构建miR-1301-3p稳定过表达和干扰细胞株。实时定量PCR(RT-PCR)验证慢病毒转染的效率,CCK8和克隆形成实验检测miR-1301-3p对胃癌细胞增殖的影响,流式周期检测miR-1301-3p对细胞周期的影响,Western检测SIRT1蛋白和周期相关蛋白的表达。3.双荧光素酶报告基因实验验证miR-1301-3p与SIRT1-3’UTR是否具有结合位点。4.在慢病毒稳定干扰miR-1301-3p细胞株中用小干扰RNA敲减SIRT1,CCK8和克隆形成检测其对细胞增殖的影响,流式周期检测其对细胞周期的影响。5.裸鼠实验进一步验证miR-1301-3p在体内对胃癌细胞增殖的影响。结果1.与癌旁正常组织和正常胃粘膜细胞相比,miR-1301-3p在胃癌组织和细胞中表达上调。2.miR-1301-3p促进胃癌细胞的增殖,促进细胞周期进程,增强G1/S期转变。3.SIRT1是miR-1301-3p下游的一个靶基因,miR-1301-3p可通过靶向调控SIRT1促进胃癌细胞增殖。SIRT1在胃癌组织中表达下调,且两者表达呈负相关。4.在慢病毒稳定干扰miR-1301-3p细胞株中敲减SIRT1可促进胃癌细胞的增殖和细胞周期进程。5.裸鼠皮下成瘤实验显示miR-1301-3p可在体内水平促进胃癌细胞的增殖。结论miR-1301-3p可通过靶向调控SIRT1的表达进而促进胃癌细胞周期进程,最终促进胃癌细胞的增殖,可为胃癌早期诊断提供新的思路,并且可作为胃癌综合治疗的一个新的潜在治疗靶点。