心房颤动(简称房颤)是临床上十分常见的一种心律失常，其发病率随着年龄的增长而增加，其主要临床危害是增加血栓栓塞的危险，有着很高的致残率，而且长期快速的心室反应可导致心动过速性心肌病，甚至引发恶性室性心律失常，危及生命。目前认为房颤的发生和维持与多发子波折返、局灶触发驱动、心房电重构、结构重构以及神经体液因子的变化等有关，是多种机制共同作用的结果，其中最为根本的是心房的电重构及结构重构，即心房肌细胞的电生理特性及相关蛋白质发生了变化，但是其具体的发生机制仍未完全阐明，需要进一步研究。房颤的发生及转归离不开机体整个内环境的改变，特别是机体中各种功能蛋白质的变化，房颤的发生和维持归根结底是机体中多种蛋白质共同作用的结果。目前的研究多局限于单一或少数几种基因或蛋白质的变化，未能从整体上去把握其全貌。蛋白质组的概念是指基因组所表达的全部蛋白质，更为清楚的表述是细胞、组织或机体在特定的时间和空间上基因组活跃表达的蛋白质。其中具有重要意义的疾病蛋白质组学研究，主要是通过比较和分析正常与异常组织细胞、同一疾病不同发展时期细胞内整体蛋白质的表达差异，对差异表达的蛋白质进行鉴定、定量、表征，寻找与疾病相关的新标志物，为人类疾病研究提供新的手段和依据，还可以作为治疗和药物开发的靶点。蛋白质组学的核心技术为二维电泳、质谱分析和生物信息学，目前已具备高通量分析和鉴定蛋白质的能力。因此，本课题拟通过建立家兔的慢性房颤动物模型，进一步观察房颤时心房电生理特性及结构的变化，同时采用蛋白质组学技术从整体水平系统比较心房肌细胞及血清在房颤时与正常窦性心律时蛋白质表达的差异，建立两者差异谱，筛选与房颤密切相关的蛋白质，为进一步阐明房颤的发生机制提供新线索。本课题拟分三部分进行，第一部分为：慢性房颤动物模型的建立及心房重构的初步观察；第二部分为：慢性房颤心房肌细胞及血清的蛋白质组学研究；第三部分为：慢性房颤差异表达蛋白质的再验证。 第一部分：慢性房颤动物模型的建立及心房重构的初步观察 目的：探讨以高频率起搏刺激心房建立家兔慢性心房颤动模型的方法并观察心房重构现象。 方法：30只家兔随机分为左心房组(10只)、右心房组(10只)及对照组(10只)，左心房组及右心房组均予开胸植入高频率起搏器(1000次/分)并起搏刺激30天，左心房组电极置于左心房心外膜，右心房组电极置于右心房心外膜，对照组亦植入起搏器但不起搏。术后定期监测起搏、心房颤动的发生情况、房颤时心室率变化，测定起搏前及房颤发生后心房有效不应期(AERP)的变化，术后30天，对照组及左心房组发生房颤(大于3周)的家兔取左心房组织作电镜检查，观察心房超微结构变化情况。 结果：左心房组术后第7天，7只(70％)兔发生了房颤，2周时共有8只(80％)发生了房颤并能稳定维持(与右心房组比较，P＜0.05)，30天时仍示房颤，其余2只兔至30天时仍呈起搏心律，而右心房组则仅有3只发生了房颤，对照组则未发生任何心律失常情况。心房颤动时的心室率最初明显增快(P＜0.05)，随后有所降低(P＜0.05)，但仍高于基础心室率(P＜0.05)。家兔左心房AERP短于右心房，房颤后左心房AERP缩短，AERP频率适应不良，与基础状态相比有显著性意义。电镜结果显示，左心房组发生房颤(大于3周)后心房肌细胞线粒体肿胀，其它细胞结构大致正常。 结论：长期高频率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房颤模型的有效方法，房颤后出现心房重构现象。 第二部分：慢性房颤心房肌细胞及血清的蛋白质组学研究 目的：研究慢性房颤家兔心房肌细胞及血清蛋白质表达的变化，寻找出差异表达的蛋白质并分析其与房颤的相互关系。 方法：采用长期高频率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房颤模型，术后30天，取房颤时间大于3周的家兔(6只)作为实验组，同时取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作为对照组，比较这两组心房肌细胞及血清蛋白表达的差异；取左心房游离壁(包括左心耳)组织进行酶解分离心房肌细胞，利用超声波破碎细胞提取蛋白，血清标本则采用心脏直接穿刺采血法收集；双向电泳技术分离蛋白质，进行凝胶图像分析比较，确定差异蛋白点，然后利用质谱(MALDI-TOF-MS)及生物信息学技术对差异蛋白点进行鉴定；最后登陆NCBI的protein网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar)，寻找相关蛋白质的资料，分析其与心房颤动的可能关系。 结果：心房肌细胞中鉴定出4个表达上调的蛋白质，即缝隙连接蛋白40、热休克蛋白70、钙调磷酸酶及肌球蛋白轻链2；血清中鉴定出1个下调表达的蛋白质为转铁蛋白，4个表达上调的蛋白质分别为补体C3前体、激肽原1、内皮素1和结合珠蛋白；功能分析显示这些蛋白质与房颤有着一定的关系。 结论：慢性房颤家兔心房肌细胞中有4个表达上调的蛋白质分别为缝隙连接蛋白40、热休克蛋白70、钙调磷酸酶及肌球蛋白轻链2，血清中鉴定出1个下调表达的蛋白质为转铁蛋白，4个表达上调的蛋白质分别为补体C3前体、激肽原1、内皮素1和结合珠蛋白，这些蛋白质与房颤可能有着密切关系。 第三部分：慢性房颤差异表达蛋白质的再验证 目的：对蛋白质组学技术鉴定出的部分差异表达蛋白质进行再验证，并进一步分析其与房颤的相互关系。 方法：采用长期高频率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房颤模型，术后30天，取房颤时间大于3周的家兔(6只)作为实验组，同时取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作为对照组；采用免疫印迹技术(Westernblot)检测左心房肌细胞中的缝隙连接蛋白40(Cx40)的表达，同时采用免疫组化技术检测缝隙连接蛋白40的表达和分布。 结果：Westernblot及免疫组化技术检测结果均显示Cx40在实验组的表达高于对照组(0.53±0.09vs0.27±0.05，P＜0.01)，且分布发生改变，在对照组中Cx40排列规整，呈线状分布于心肌细胞之间端一端连接的闰盘处，而在实验组中Cx40排列紊乱，异常分布于心房肌细胞的侧边、细胞浆中与细胞核周围，仅少量呈线状位于闰盘。 结论：慢性房颤可引起缝隙连接蛋白40表达量增加且分布发生改变，提示缝隙连接蛋白40可能参与了房颤的发生和维持，与蛋白质组学技术分析结果一致，证明蛋白质组学技术是准确可靠的。 通过以上研究，我们认为长期高频率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房颤模型的有效方法，心房颤动可导致家兔发生心房重构，提示心房重构是房颤发生和维持的一个重要机制。利用蛋白质组学技术，我们鉴定出了4个上调表达的细胞蛋白质和5个差异表达的血清蛋白质，这些蛋白质可能均参与了房颤的发生和维持，提示房颤的发生可能是多种机制、多种蛋白质、多环节共同作用的结果。免疫印迹和免疫组化技术对缝隙连接蛋白40的检测结果与蛋白质组研究结果相一致，提示蛋白质组学技术是一项准确可靠的技术。本研究发现的差异表达的蛋白质今后仍需继续进一步深入研究。