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【摘要】早孕因子（Early Pregnancy Factor，EPF）是一种存在于哺乳动物妊娠过程中的免疫抑制因子，目前认为是分子伴侣10（Cnp10）的同源物质，是最早作为明确妊娠的一批生化指标之一。本文对EPF的发展历程、来源、本质和特性及其分离、纯化、检测和应用进行阐述，说明国内外的研究现状及进展，并加以总结，了解到EPF不仅在超早期妊娠检测中具有重要作用，在治疗肿瘤和免疫相关疾病、胚胎移植、人工授精甚至在畜牧业中也起到重要作用。EPF的提纯和检测方面在近几年取得明显的成果，使EPF能运用于更广泛的领域。
【关键词】早孕因子、检测方法、应用
早孕因子 （early pregnancy factor，EPF）是在妊娠早期哺乳动物血清中存在的一种分泌蛋白，由澳大利亚学者Morton等在1974年寻找一种用于移植的天然生物模型的实验中意外发现。由于它在受精后6～14小时即能从母体血清中检测到，因此被认为是确定妊娠的最早的生化指标之一。
1 早孕因子本质
早孕因子（EPF）是一种具有免疫抑制、耐热、耐透析和较强耐酸碱性质的糖蛋白，且无物种特异性，大部分动物EPF相对分子质量约在10 000～450 000[1]。1991年Clarke[2]等研究认为EPF活性的表达是由硫氧还原蛋白（thioredoxin，TRX）与孕妇血清共同作用除去RITS抗体，引起EPF活性的表达，从而证明EPF在试验中只起到调节作用。Aranha[3]通过实验测得孕妇淋巴细胞中存在EPF活性，认为在孕妇怀孕期间EPF可能是FC受体样分子。2004年Cheng等[4]首次在孕妇宫颈粘液中发现EPF活性，血清中观察到的平行变化，可能是用于评估胚胎活力的另一个有用的指标。往后的众多实验表明，EPF的活性并非由单一因素引起，而是通过各种早孕因子影响要素共同作用产生的生物活性。
1994年Cavanagh[5]通过研究确定EPF是热休克分子家族的成员，并执行细胞外分子伴侣的作用。Morton等[6]认为EPF与细胞外伴侣蛋白10（Cpn10）属于同源物质。Cpn10是在小鼠线粒体内发现的一种起着分子伴侣作用修饰其他蛋白质的物质，但是并不能通过花环抑制试验，2000年Kawamura等[7]通过检测不同阶段的Cpn10和Cpn60mRNA在卵母细胞和胚胎中的表达，用花环抑制试验对大鼠Cpn10的EPF活性进行评价，结果提示每个阶段卵母细胞和胚胎中均检测到Cpn10和Cpn60的相同mRNA表达水平，而在正常细胞的CPN 10中没有检测到EPF活性。由于使用多克隆抗体免疫沉淀CPN 10不影响孕鼠血清EPF活性，所以证明Cpn10与EPF并非相同的物质。
2 早孕因子来源
EPF最初是从孕鼠受精后4～6小时的血清中发现，1974年Morton等[8]科学家首次发现在孕鼠交配后6h产生的一种具有生长因子性质的蛋白质，且能使T淋巴细胞产生玫瑰花环的过程受阻，由此产生了检测EPF的经典实验方法——玫瑰花环抑制试验（RIT）。随后也在猪受精后4小时，绵羊6小时，牛24～26小时的血清中发现EPF，1983年Rolfe等[9]在所有11例非感染性肿瘤患者和10例精原细胞瘤患者中，检测到tEPF或其自由组分tEPF-A和tEPF-B。在健康男性对照组和非生殖细胞肿瘤或良性睾丸疾病患者的血清中未检测到，推测EPF可能是生殖细胞瘤的一个肿瘤标志物。1997年Lash等[10-11]通过实验研究发现，胚胎条件培养基、血小板活化因子和皮质颗粒释放培养基都可以通过雌性小鼠卵巢和输卵管刺激早期妊娠因子的产生，这种刺激被血小板激活因子受体拮抗剂的存在完全阻断，实验表明血小板活化因子是受精卵释放的卵因子，启动早孕因子合成。
3 EPF的分离、纯化和检测
3.1 EPF分离、纯化
在EPF发现后的这么多年里，至今未发现成功高效分离纯化EPF的例子。但是在近几年EPF的纯化率比起以前有了提高。目前EPF活性物质大多数是从妊娠母体的血清中获取。但由于EPF的来源、实验室条件等限制，EPF的特性也各不相同，分离和纯化的方法也有所区别，目前天然EPF主要纯化方法仍以层析和过滤为主。2012年温志峰等[12]对正常早孕妇女血清中早孕因子（EPF）的分离纯化过程进行优化，采用两步法，依次使用DEAE Fast Flow 离子交换色谱和 Heparin Fast Flow 亲和色谱，从妊娠 12 周内的正常早孕妇女混合血清中提纯EPF，明显提高了纯化效率。随着基因工程的发展，EPF的氨基酸序列已经被破解，已经有人通过基因工程制备出重组EPF，其性质与天然提取的EPF并无区别。2002年Morton等[6]分别用重组原核和真核表达系统制备重组EPF，以两种产品和天然EPF比较生物活性，他们发现两者免疫抑制性质无显著差异。吴晓亮、郑玮璐[13-14]利用基因工程技术制备EPF重组蛋白。练玉银、杜晓明、刘云等[15-17]利用基因工程技术克隆出了EPF 基因，从而获得了大量具有良好生物学特性的 EPF 重组蛋白，有利于更好的帮助了解母体对胚胎是否产生免疫耐受。吴晓亮[13]、刘云[17]和刘静静[18]分别以小鼠、奶牛和绵羊为实验对象利用基因工程制备出EPF单克隆抗体，为早孕诊断试剂的开发和某些恶性肿瘤的早期诊断奠定基础。
3.2 EPF检测
对于EPF活性的检测大部分人一直沿用最初的RIT法，但是此法缺点十分明显：实验操作复杂、需要条件不易控制且耗时长，最重要的是所得结果人为主观性较强，因此人们一直探寻更好的检测方法。1997年Fan等[19]通过实验明确超早期妊娠可以通过检测孕妇血清中排卵后2天的EPF活性，精度为88.6%，这为妊娠期妇女意外终止妊娠或意外怀孕的妇女提供了诊断依据，有助于计划生育。2000年Ohnuma等[20]将玫瑰花环试验应用于马，并提出此方法是有用的马怀孕诊断标准。2000年张冬云等[21]采用DEAE 纤维素离子交换层分析，S-Sepharosefastflow离子交换层析，ConA-SepharoseCl4B亲和层析，Heparin-SepharoseCl6B亲和层析等方法进行纯化，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳法分别检测肽图和等电点，结果与国内外报道的从孕妇血清中提取的EPF活性一致。2003年孙文东等[22]采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、CM-Sepharose柱层析、玫瑰花环抑制滴度试验、SDS- PAGE和等电聚焦等技术对 EPF进行生化特性的研究，结果与国内外相关研究一致。尽管检测方法在众多学者研究下的不断成熟完善，但仍需不斷寻找更优越、简便和实用的方法。 4 EPF的應用研究
4.1 临床应用
4.1.1 超早期妊娠诊断
由于能够在动物受精后较短时间内检测出EPF活性，这比检测到人绒毛膜促性腺激素升高的时间要早很多，Fan等[23]通过研究得出利用RIT试验检测EPF，阳性率为 88.6%，假阳性率为 17.1%，假阴性率为 3.4%，而检测此时的HCG水平则很低，并且EPF在血液循环中活性相对更明显。因此EPF适合于超早期妊娠的诊断，能提前确认妊娠情况和对胚胎进行观察，有针对性的对孕妇进行保健服务。且在近几年制备出的EPF单克隆抗体使得EPF的准确检测提供可能。
4.1.2 肿瘤的早期诊断
1997年Fan[23]研究表明，诊断恶性滋养层的肿瘤可通过检测EPF样活动以及精度91.3%EPF样活动可以作为区分良性和恶性肿瘤滋养层的指标。目前可以通过RIT试验测定 EPF的值，可以诊断膀胱癌、黑色素瘤、绒癌、恶性葡萄胎等 4 种肿瘤血清和恶性葡萄胎清宫人流血及黑色素瘤[14]，因此用检测EPF活性来对早期肿瘤及判断是否为恶性肿瘤是可行的，且具有较高准确率。
4.1.3 肿瘤的治疗
1990年Quinn等[24]通过在接种 MCA-2 肿瘤细胞的小鼠的体内每天注射四次抗EPF IGM，每次500ug，发现13天后EPF及tEPF的特异性抗体能清除所有tEPF活性肿瘤细胞，提出EPF是培养和转化肿瘤细胞生长的产品。除此，也有人提出利用荧光标记后的EPF单克隆抗体携带治疗药物，直接作用于癌症病灶。因此，利用EPF的特性治疗相关肿瘤具有广阔的前景。
4.2 其他应用
2015年卜建华[25]认为可以将EPF应用于畜牧业，用于发现奶牛屡配不孕的难题，能提前知晓是卵巢疾病还是公牛精子的原因导致不孕。若是配种后发现无EPF活性，这说明是由于受精导致不孕，若是配种后EPF升高，随后降低至阴性水平，提示死胎。除此以外，EPF可应用于溃疡、类风湿、胚胎移植和人工受精方面的治疗。
参考文献
[1] Cavanagh A C. Identification of early pregnancy factor as chaperonin 10：implications for understanding its role [J]. Rev Reprod.
[2] Clarke F M， Orozco C， Perkins A V， et al. Identification of molecules involved in the 'early pregnancy factor' phenomenon.[J]. Journal of Reproduction & Fertility， 1991， 93（2）：525.
[3] Aranha C， Bordekar A， Shahani S. Isolation and Purification of an Early Pregnancy Factor–like Molecule from Culture Supernatants Obtained from Lymphocytes of Pregnant Women： II. Identification of the Molecule as a FC-Receptor–like Molecule： A Preliminary Report[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics， 1998， 15（10）：619-24.
[4] Cheng S J， Zheng Z Q. Early pregnancy factor in cervical mucus of pregnant women.[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2004， 51（2）：102-105.
[5] Cavanagh A C， Morton H. The purification of early-pregnancy factor to homogeneity from human platelets and identification as chaperonin 10.[J]. European Journal of Biochemistry， 1994， 222（2）：551.
[6] Morton H， Mckay D A， Murphy R M， et al. Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats[J]. Immunology & Cell Biology， 2000， 78（6）：603-7.
[7] Kawamura K， Fukuda J， Itoh H， et al. Chaperonin 10 in the rat oocytes and early embryos： its expression and activity for early pregnancy factor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 44（4）：242.
[8] Morton H， Hegh V， Clunie G J. Immunosuppression detected in pregnant mice by rosette inhibition test.[J]. Nature， 1974， 249（456）：459. [9] Rolfe B E， Morton H， Cavanagh A C， et al. Detection of an Early Pregnancy Factor-Like Substance in Sera of Patients With Testicular Germ Cell Tumors[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1983， 3（2）：97-100.
[10] Lash G E， Legge M. Induction of early pregnancy factor activity in vitro by platelet-activating factor in mice.[J]. J Reprod Fertil， 1997， 109（2）：187-91.
[11] Ito K， Takahashi M， Kawahata K， et al. Supplementation effect of early pregnancy factor-positive serum into bovine in vitro fertilization culture medium[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1998， 39（6）：356-61.
[12] 温志锋， 练玉银， 王家骥，等. 早孕因子分离纯化方法的优化[J]. 免疫学杂志， 2012（12）：1073-1076.
[13] 吴晓亮. 肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定[D]. 广州医学院， 2011.
[14] 郑玮璐， 刘为民， 陈芳，等. Hela细胞早孕因子基因的克隆与原核表达[J]. 动物医学进展， 2015， 36（5）：11-15.
[15] 练玉银， 王家骥. 重组早孕因子（EPF）的表达、纯化及鉴定[J].生殖与避孕， 2012， 32（3）： 156-160.
[16] 杜晓明， 张改平， 王丽， 等. 重组人早孕因子的表达与纯化[J].中国农学通报， 2011， 27（14）： 40-44.
[17] LIU Yun， JIA Bin， SHI Feng，等. 奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[J]. 中国畜牧兽医， 2015， 42（4）：877-882.
[18] 刘静静， 刘月琴. 绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定[C]// 全国养羊生产与学术研讨会. 2015.
[19] Fan X G， Zheng Z Q， Fan X G， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in Preimplantation[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1997， 37（5）：359-64.
[20] Ohnuma K， Yokoo M， Ito K， et al. Study of early pregnancy factor （EPF） in equine （Equus caballus）.[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 43（3）：174-9.
[21] 张冬云， 王家骥， 林丽白，等. "人流血"中早孕因子的分离、纯化及鉴定[J]. 中国生物制品学杂志， 2000， 13（3）：151-153.
[22] 孙文东， 吴瑞英， 邓雁如，等. 孕牛血清中早孕因子的生化特性研究[J]. 新疆医科大学学报， 2003， 26（3）：222-223.
[23] Fan X， Yan L， Jia S， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in the Sera of Women with Trophoblastic Tumor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1999， 41（3）：204-208.
[24] Quinn K A， Athanasas-Platsis S， Wong T Y， et al. Monoclonal antibodies to early pregnancy factor perturb tumour cell growth.[J]. Clinical & Experimental Immunology， 1990， 80（1）：100-8.
[25]卜建華， 雷静， 李艳艳，等. 奶牛早期妊娠诊断研究进展[J]. 宁夏农林科技， 2015， 56（11）：54-55.
作者简介
钟永怡（1993-），女，汉族，广东清远，硕士研究生，广州华立科技职业学院， 511325 ，公共卫生与预防医学。
本文系：医养结合技术研究所（HLZ142010）;
【关键词】早孕因子、检测方法、应用
早孕因子 （early pregnancy factor，EPF）是在妊娠早期哺乳动物血清中存在的一种分泌蛋白，由澳大利亚学者Morton等在1974年寻找一种用于移植的天然生物模型的实验中意外发现。由于它在受精后6～14小时即能从母体血清中检测到，因此被认为是确定妊娠的最早的生化指标之一。
1 早孕因子本质
早孕因子（EPF）是一种具有免疫抑制、耐热、耐透析和较强耐酸碱性质的糖蛋白，且无物种特异性，大部分动物EPF相对分子质量约在10 000～450 000[1]。1991年Clarke[2]等研究认为EPF活性的表达是由硫氧还原蛋白（thioredoxin，TRX）与孕妇血清共同作用除去RITS抗体，引起EPF活性的表达，从而证明EPF在试验中只起到调节作用。Aranha[3]通过实验测得孕妇淋巴细胞中存在EPF活性，认为在孕妇怀孕期间EPF可能是FC受体样分子。2004年Cheng等[4]首次在孕妇宫颈粘液中发现EPF活性，血清中观察到的平行变化，可能是用于评估胚胎活力的另一个有用的指标。往后的众多实验表明，EPF的活性并非由单一因素引起，而是通过各种早孕因子影响要素共同作用产生的生物活性。
1994年Cavanagh[5]通过研究确定EPF是热休克分子家族的成员，并执行细胞外分子伴侣的作用。Morton等[6]认为EPF与细胞外伴侣蛋白10（Cpn10）属于同源物质。Cpn10是在小鼠线粒体内发现的一种起着分子伴侣作用修饰其他蛋白质的物质，但是并不能通过花环抑制试验，2000年Kawamura等[7]通过检测不同阶段的Cpn10和Cpn60mRNA在卵母细胞和胚胎中的表达，用花环抑制试验对大鼠Cpn10的EPF活性进行评价，结果提示每个阶段卵母细胞和胚胎中均检测到Cpn10和Cpn60的相同mRNA表达水平，而在正常细胞的CPN 10中没有检测到EPF活性。由于使用多克隆抗体免疫沉淀CPN 10不影响孕鼠血清EPF活性，所以证明Cpn10与EPF并非相同的物质。
2 早孕因子来源
EPF最初是从孕鼠受精后4～6小时的血清中发现，1974年Morton等[8]科学家首次发现在孕鼠交配后6h产生的一种具有生长因子性质的蛋白质，且能使T淋巴细胞产生玫瑰花环的过程受阻，由此产生了检测EPF的经典实验方法——玫瑰花环抑制试验（RIT）。随后也在猪受精后4小时，绵羊6小时，牛24～26小时的血清中发现EPF，1983年Rolfe等[9]在所有11例非感染性肿瘤患者和10例精原细胞瘤患者中，检测到tEPF或其自由组分tEPF-A和tEPF-B。在健康男性对照组和非生殖细胞肿瘤或良性睾丸疾病患者的血清中未检测到，推测EPF可能是生殖细胞瘤的一个肿瘤标志物。1997年Lash等[10-11]通过实验研究发现，胚胎条件培养基、血小板活化因子和皮质颗粒释放培养基都可以通过雌性小鼠卵巢和输卵管刺激早期妊娠因子的产生，这种刺激被血小板激活因子受体拮抗剂的存在完全阻断，实验表明血小板活化因子是受精卵释放的卵因子，启动早孕因子合成。
3 EPF的分离、纯化和检测
3.1 EPF分离、纯化
在EPF发现后的这么多年里，至今未发现成功高效分离纯化EPF的例子。但是在近几年EPF的纯化率比起以前有了提高。目前EPF活性物质大多数是从妊娠母体的血清中获取。但由于EPF的来源、实验室条件等限制，EPF的特性也各不相同，分离和纯化的方法也有所区别，目前天然EPF主要纯化方法仍以层析和过滤为主。2012年温志峰等[12]对正常早孕妇女血清中早孕因子（EPF）的分离纯化过程进行优化，采用两步法，依次使用DEAE Fast Flow 离子交换色谱和 Heparin Fast Flow 亲和色谱，从妊娠 12 周内的正常早孕妇女混合血清中提纯EPF，明显提高了纯化效率。随着基因工程的发展，EPF的氨基酸序列已经被破解，已经有人通过基因工程制备出重组EPF，其性质与天然提取的EPF并无区别。2002年Morton等[6]分别用重组原核和真核表达系统制备重组EPF，以两种产品和天然EPF比较生物活性，他们发现两者免疫抑制性质无显著差异。吴晓亮、郑玮璐[13-14]利用基因工程技术制备EPF重组蛋白。练玉银、杜晓明、刘云等[15-17]利用基因工程技术克隆出了EPF 基因，从而获得了大量具有良好生物学特性的 EPF 重组蛋白，有利于更好的帮助了解母体对胚胎是否产生免疫耐受。吴晓亮[13]、刘云[17]和刘静静[18]分别以小鼠、奶牛和绵羊为实验对象利用基因工程制备出EPF单克隆抗体，为早孕诊断试剂的开发和某些恶性肿瘤的早期诊断奠定基础。
3.2 EPF检测
对于EPF活性的检测大部分人一直沿用最初的RIT法，但是此法缺点十分明显：实验操作复杂、需要条件不易控制且耗时长，最重要的是所得结果人为主观性较强，因此人们一直探寻更好的检测方法。1997年Fan等[19]通过实验明确超早期妊娠可以通过检测孕妇血清中排卵后2天的EPF活性，精度为88.6%，这为妊娠期妇女意外终止妊娠或意外怀孕的妇女提供了诊断依据，有助于计划生育。2000年Ohnuma等[20]将玫瑰花环试验应用于马，并提出此方法是有用的马怀孕诊断标准。2000年张冬云等[21]采用DEAE 纤维素离子交换层分析，S-Sepharosefastflow离子交换层析，ConA-SepharoseCl4B亲和层析，Heparin-SepharoseCl6B亲和层析等方法进行纯化，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳法分别检测肽图和等电点，结果与国内外报道的从孕妇血清中提取的EPF活性一致。2003年孙文东等[22]采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、CM-Sepharose柱层析、玫瑰花环抑制滴度试验、SDS- PAGE和等电聚焦等技术对 EPF进行生化特性的研究，结果与国内外相关研究一致。尽管检测方法在众多学者研究下的不断成熟完善，但仍需不斷寻找更优越、简便和实用的方法。 4 EPF的應用研究
4.1 临床应用
4.1.1 超早期妊娠诊断
由于能够在动物受精后较短时间内检测出EPF活性，这比检测到人绒毛膜促性腺激素升高的时间要早很多，Fan等[23]通过研究得出利用RIT试验检测EPF，阳性率为 88.6%，假阳性率为 17.1%，假阴性率为 3.4%，而检测此时的HCG水平则很低，并且EPF在血液循环中活性相对更明显。因此EPF适合于超早期妊娠的诊断，能提前确认妊娠情况和对胚胎进行观察，有针对性的对孕妇进行保健服务。且在近几年制备出的EPF单克隆抗体使得EPF的准确检测提供可能。
4.1.2 肿瘤的早期诊断
1997年Fan[23]研究表明，诊断恶性滋养层的肿瘤可通过检测EPF样活动以及精度91.3%EPF样活动可以作为区分良性和恶性肿瘤滋养层的指标。目前可以通过RIT试验测定 EPF的值，可以诊断膀胱癌、黑色素瘤、绒癌、恶性葡萄胎等 4 种肿瘤血清和恶性葡萄胎清宫人流血及黑色素瘤[14]，因此用检测EPF活性来对早期肿瘤及判断是否为恶性肿瘤是可行的，且具有较高准确率。
4.1.3 肿瘤的治疗
1990年Quinn等[24]通过在接种 MCA-2 肿瘤细胞的小鼠的体内每天注射四次抗EPF IGM，每次500ug，发现13天后EPF及tEPF的特异性抗体能清除所有tEPF活性肿瘤细胞，提出EPF是培养和转化肿瘤细胞生长的产品。除此，也有人提出利用荧光标记后的EPF单克隆抗体携带治疗药物，直接作用于癌症病灶。因此，利用EPF的特性治疗相关肿瘤具有广阔的前景。
4.2 其他应用
2015年卜建华[25]认为可以将EPF应用于畜牧业，用于发现奶牛屡配不孕的难题，能提前知晓是卵巢疾病还是公牛精子的原因导致不孕。若是配种后发现无EPF活性，这说明是由于受精导致不孕，若是配种后EPF升高，随后降低至阴性水平，提示死胎。除此以外，EPF可应用于溃疡、类风湿、胚胎移植和人工受精方面的治疗。
参考文献
[1] Cavanagh A C. Identification of early pregnancy factor as chaperonin 10：implications for understanding its role [J]. Rev Reprod.
[2] Clarke F M， Orozco C， Perkins A V， et al. Identification of molecules involved in the 'early pregnancy factor' phenomenon.[J]. Journal of Reproduction & Fertility， 1991， 93（2）：525.
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[6] Morton H， Mckay D A， Murphy R M， et al. Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats[J]. Immunology & Cell Biology， 2000， 78（6）：603-7.
[7] Kawamura K， Fukuda J， Itoh H， et al. Chaperonin 10 in the rat oocytes and early embryos： its expression and activity for early pregnancy factor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 44（4）：242.
[8] Morton H， Hegh V， Clunie G J. Immunosuppression detected in pregnant mice by rosette inhibition test.[J]. Nature， 1974， 249（456）：459. [9] Rolfe B E， Morton H， Cavanagh A C， et al. Detection of an Early Pregnancy Factor-Like Substance in Sera of Patients With Testicular Germ Cell Tumors[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1983， 3（2）：97-100.
[10] Lash G E， Legge M. Induction of early pregnancy factor activity in vitro by platelet-activating factor in mice.[J]. J Reprod Fertil， 1997， 109（2）：187-91.
[11] Ito K， Takahashi M， Kawahata K， et al. Supplementation effect of early pregnancy factor-positive serum into bovine in vitro fertilization culture medium[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1998， 39（6）：356-61.
[12] 温志锋， 练玉银， 王家骥，等. 早孕因子分离纯化方法的优化[J]. 免疫学杂志， 2012（12）：1073-1076.
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[16] 杜晓明， 张改平， 王丽， 等. 重组人早孕因子的表达与纯化[J].中国农学通报， 2011， 27（14）： 40-44.
[17] LIU Yun， JIA Bin， SHI Feng，等. 奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[J]. 中国畜牧兽医， 2015， 42（4）：877-882.
[18] 刘静静， 刘月琴. 绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定[C]// 全国养羊生产与学术研讨会. 2015.
[19] Fan X G， Zheng Z Q， Fan X G， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in Preimplantation[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1997， 37（5）：359-64.
[20] Ohnuma K， Yokoo M， Ito K， et al. Study of early pregnancy factor （EPF） in equine （Equus caballus）.[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 2000， 43（3）：174-9.
[21] 张冬云， 王家骥， 林丽白，等. "人流血"中早孕因子的分离、纯化及鉴定[J]. 中国生物制品学杂志， 2000， 13（3）：151-153.
[22] 孙文东， 吴瑞英， 邓雁如，等. 孕牛血清中早孕因子的生化特性研究[J]. 新疆医科大学学报， 2003， 26（3）：222-223.
[23] Fan X， Yan L， Jia S， et al. A Study of Early Pregnancy Factor Activity in the Sera of Women with Trophoblastic Tumor[J]. American Journal of Reproductive Immunology， 1999， 41（3）：204-208.
[24] Quinn K A， Athanasas-Platsis S， Wong T Y， et al. Monoclonal antibodies to early pregnancy factor perturb tumour cell growth.[J]. Clinical & Experimental Immunology， 1990， 80（1）：100-8.
[25]卜建華， 雷静， 李艳艳，等. 奶牛早期妊娠诊断研究进展[J]. 宁夏农林科技， 2015， 56（11）：54-55.
作者简介
钟永怡（1993-），女，汉族，广东清远，硕士研究生，广州华立科技职业学院， 511325 ，公共卫生与预防医学。
本文系：医养结合技术研究所（HLZ142010）;