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摘要：目的 优选桑白皮多糖最佳提取工艺。方法 采用正交试验设计，以提取次数、提取时间及醇沉浓度作为工艺因素，每个因素采用3个水平，选择L9（34）正交表进行试验，同时用硫酸-苯酚法测定桑白皮多糖的含量作为评价指标。结果 桑白皮多糖的最佳提取工艺为超声提取30 min，提取2次，醇沉浓度为80%。结论 优选的工艺多糖提取率稳定，提取率高，提取工艺合理可行。
关键词：桑白皮多糖；正交试验；提取工艺；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.018
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0046-02
桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，具有泻肺平喘、利水消肿之功效，用于治疗肺热喘咳、水肿胀满、尿少、面目肌肤浮肿等症[1]。其有效成分桑白皮多糖治疗糖尿病及其并发症有良好的疗效[2]。目前国内许多学者从不同角度研究桑白皮在降糖、降压、利尿、镇咳平喘、抗艾滋病毒（HIV）、抗肿瘤和中药配伍等方面的药效[3-4]，但对桑白皮多糖提取工艺的研究较少。笔者采用正交试验法对桑白皮多糖提取工艺进行优选。
1 仪器与试药
R-205型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司），SHZ-D（Ⅱ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），LDZ4-1.2型离心机（BEIJING JINGLI），DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），Sartorius BT 224S分析天平，TU-1901双光束紫外可见分光光度计。
桑白皮药材由广东康臣药业集团提供，批号20110910；AB-8型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂；95%乙醇、丙酮、活性炭、蒽酮、硫酸及其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 原料处理与样品制备
2.1.1 药材前处理 桑白皮除去泥土后放入烘箱烘干至恒重，破碎，密封备用。
2.1.2 对照品制备 取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，精密称定，于100 mL容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀后备用。
2.1.3 供试品制备 取干燥桑白皮药材100.0 g，破碎，加10倍量水，超声提取，提取液减压浓缩至相对药材比为1∶1， 3 500 r/min离心10 min，取上清液走柱，层析柱用AB-8型大孔吸附树脂湿法填充，在大孔吸附树脂柱中用纯化水洗至洗脱液加入95%乙醇无沉淀为止，再将洗脱液浓缩至约100 mL，加入活性炭脱色，趁热过滤，滤液浓缩后加入95%乙醇使含醇量达正交表所设计的浓度，静置后抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮各洗3次，60 ℃低温干燥，得到白色无定形粉末，称重，精密称取，配制成浓度为20 ?g/mL的溶液，备用。
2.2 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液1 mL于5 mL容量瓶中，加纯化水定容。分别精取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置20 mL容量瓶中，加纯化水定容。分别精密吸取2.0 mL于试管中，加苯酚1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，迅速摇匀，静置5 min，沸水浴加热15 min，冷至室温，分光光度法于490 nm波长处测吸收度。得标准曲线Y=6.885 7X+1.175 1，r2=0.999 6。结果表明，对照品在0～25 ?g范围内线性关系良好。
2.3 精密度试验
取供试品溶液，以空白液为参比，在490 nm处测定吸光度，连续6次重复测定，结果RSD=0.81%，表明精密度良好。
2.4 重复性试验
取同一批样品5份，按照供试品溶液制备方法处理后进行含量测定，求得RSD=1.40%，表明本法重复性良好。
2.5 稳定性试验
取制备好的供试品溶液，室温下，在15、30、45、60、120 min测定吸光度，其RSD=1.23%，表明供试品在120 min内稳定。
2.6 加样回收率试验
精密吸取含葡萄糖0.5 mg/mL的对照品溶液1.6、2.0、2.4 mL，各3份，置100 mL容量瓶中，加入样品1.0 mg，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备，分别精密吸取2.0 mL于试管中，加苯酚1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，迅速摇匀，静置5 min，沸水浴加热15 min，冷至室温，分光光度法于490 nm波长处测吸收度，计算回收率。结果高、中、低3种加入量的回收率分别为（100.02±0.34）%、（100.32±0.22）%、（100.24±0.36）%，平均回收率为100.19%（n=9），RSD=1.16%。表明本法准确度良好。
2.7 工艺考察
2.7.1 正交试验设计 利用正交试验法“均衡分散”特点，以超声时间、提取次数、醇沉浓度为考察因素，采用L9（34）正交表进行试验，以测得的多糖含量为考察指标，确定最佳工艺，因素水平见表1。
2.7.2 正交试验结果与分析 根据表1进行试验，试验结果见表2，方差分析见表3。
根据表2中极差R的大小，各因素对多糖含量的影响主次顺序为C>A>B，即醇沉浓度>超声时间>提取次数。从表3方差分析可见，醇沉浓度对桑白皮多糖的提取有显著影响。综合分析结果确定超声提取的最佳工艺是：超声提取30 min，提取2次，加95%乙醇使含醇量达80%，产量为3.943 8 g。
2.7.3 验证试验 根据正交试验结果对A2B2C3工艺条件重复3次试验，以验证该工艺的合理性和稳定性，结果RSD=1.21%，测得桑白皮中多糖的平均含量为3.898 7 g。
3 讨论
按上述提取方法提取的桑白皮多糖溶于水，尤易溶于热水，不溶于高浓度的乙醇和丙酮，Molish反应和蒽酮-浓硫酸反应都显阳性，说明白色粉末中含多糖；茚三酮反应均为阴性，说明无蛋白质；Liebermann-Burchard反应和Salkanski反应时，均为阴性，说明提取物中无甾醇类化合物；醋酸纤维薄膜电泳：硼酸缓冲液0.2 mol/L，pH=9.2，醋酸纤维薄膜（3 cm×10 cm）载体，3%阿利新蓝醋酸溶液作显色剂，电压340 V，时间40 min，均为单一蓝色色带向负极方向泳动。可确定白色粉末为较纯桑白皮多糖。
本试验利用超声法提取多糖相对其他方法有较大的优势：提取时间缩短，提取率随之提高；提取过程无须加热，避免桑白皮多糖的分解；所用仪器、试剂简单易得，操作方便，超声仪自动化程度高，便于大规模工业化生产。因为超声提取时间过长，可能导致多糖分子结构发生变化，糖链断裂，使多糖提取含量下降，故本试验对超声提取时间进行了考察。
供试品制备时上大孔树脂，目的是除去桑白皮中其他非糖类化合物，提高多糖纯度，减少杂质对桑白皮多糖含量的测定。
目前国内对桑白皮多糖工艺方面的研究极少，笔者就超声提取进行研究分析，研究范围单一。因此，有必要对桑白皮多糖进行深入研究，尤其对提取工艺、分离方法等进行多组份对比试验研究，从而筛选出最优的提取、分离、纯化方案。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：280.
[2] 马松涛，王秋林，张效科.桑白皮提取物对实验性糖尿病神经病变的保护作用[J].中华中医药杂志，2006，21（12）：776-777.
[3] 孙静芸，徐宝林，张文娟.桑白皮平喘、利尿有效成分研究[J].中国中药杂志，2002，27（5）：366-367.
[4] 罗士德，J Nemec，宁冰梅.桑白皮中抗人HIV成分研究[J].云南植物研究，1995，17（1）：89-95.
（收稿日期：2012-03-10，编辑：陈静）
关键词：桑白皮多糖；正交试验；提取工艺；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.018
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0046-02
桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，具有泻肺平喘、利水消肿之功效，用于治疗肺热喘咳、水肿胀满、尿少、面目肌肤浮肿等症[1]。其有效成分桑白皮多糖治疗糖尿病及其并发症有良好的疗效[2]。目前国内许多学者从不同角度研究桑白皮在降糖、降压、利尿、镇咳平喘、抗艾滋病毒（HIV）、抗肿瘤和中药配伍等方面的药效[3-4]，但对桑白皮多糖提取工艺的研究较少。笔者采用正交试验法对桑白皮多糖提取工艺进行优选。
1 仪器与试药
R-205型旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司），SHZ-D（Ⅱ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），LDZ4-1.2型离心机（BEIJING JINGLI），DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），Sartorius BT 224S分析天平，TU-1901双光束紫外可见分光光度计。
桑白皮药材由广东康臣药业集团提供，批号20110910；AB-8型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂；95%乙醇、丙酮、活性炭、蒽酮、硫酸及其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 原料处理与样品制备
2.1.1 药材前处理 桑白皮除去泥土后放入烘箱烘干至恒重，破碎，密封备用。
2.1.2 对照品制备 取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，精密称定，于100 mL容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀后备用。
2.1.3 供试品制备 取干燥桑白皮药材100.0 g，破碎，加10倍量水，超声提取，提取液减压浓缩至相对药材比为1∶1， 3 500 r/min离心10 min，取上清液走柱，层析柱用AB-8型大孔吸附树脂湿法填充，在大孔吸附树脂柱中用纯化水洗至洗脱液加入95%乙醇无沉淀为止，再将洗脱液浓缩至约100 mL，加入活性炭脱色，趁热过滤，滤液浓缩后加入95%乙醇使含醇量达正交表所设计的浓度，静置后抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮各洗3次，60 ℃低温干燥，得到白色无定形粉末，称重，精密称取，配制成浓度为20 ?g/mL的溶液，备用。
2.2 标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液1 mL于5 mL容量瓶中，加纯化水定容。分别精取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置20 mL容量瓶中，加纯化水定容。分别精密吸取2.0 mL于试管中，加苯酚1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，迅速摇匀，静置5 min，沸水浴加热15 min，冷至室温，分光光度法于490 nm波长处测吸收度。得标准曲线Y=6.885 7X+1.175 1，r2=0.999 6。结果表明，对照品在0～25 ?g范围内线性关系良好。
2.3 精密度试验
取供试品溶液，以空白液为参比，在490 nm处测定吸光度，连续6次重复测定，结果RSD=0.81%，表明精密度良好。
2.4 重复性试验
取同一批样品5份，按照供试品溶液制备方法处理后进行含量测定，求得RSD=1.40%，表明本法重复性良好。
2.5 稳定性试验
取制备好的供试品溶液，室温下，在15、30、45、60、120 min测定吸光度，其RSD=1.23%，表明供试品在120 min内稳定。
2.6 加样回收率试验
精密吸取含葡萄糖0.5 mg/mL的对照品溶液1.6、2.0、2.4 mL，各3份，置100 mL容量瓶中，加入样品1.0 mg，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备，分别精密吸取2.0 mL于试管中，加苯酚1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，迅速摇匀，静置5 min，沸水浴加热15 min，冷至室温，分光光度法于490 nm波长处测吸收度，计算回收率。结果高、中、低3种加入量的回收率分别为（100.02±0.34）%、（100.32±0.22）%、（100.24±0.36）%，平均回收率为100.19%（n=9），RSD=1.16%。表明本法准确度良好。
2.7 工艺考察
2.7.1 正交试验设计 利用正交试验法“均衡分散”特点，以超声时间、提取次数、醇沉浓度为考察因素，采用L9（34）正交表进行试验，以测得的多糖含量为考察指标，确定最佳工艺，因素水平见表1。
2.7.2 正交试验结果与分析 根据表1进行试验，试验结果见表2，方差分析见表3。
根据表2中极差R的大小，各因素对多糖含量的影响主次顺序为C>A>B，即醇沉浓度>超声时间>提取次数。从表3方差分析可见，醇沉浓度对桑白皮多糖的提取有显著影响。综合分析结果确定超声提取的最佳工艺是：超声提取30 min，提取2次，加95%乙醇使含醇量达80%，产量为3.943 8 g。
2.7.3 验证试验 根据正交试验结果对A2B2C3工艺条件重复3次试验，以验证该工艺的合理性和稳定性，结果RSD=1.21%，测得桑白皮中多糖的平均含量为3.898 7 g。
3 讨论
按上述提取方法提取的桑白皮多糖溶于水，尤易溶于热水，不溶于高浓度的乙醇和丙酮，Molish反应和蒽酮-浓硫酸反应都显阳性，说明白色粉末中含多糖；茚三酮反应均为阴性，说明无蛋白质；Liebermann-Burchard反应和Salkanski反应时，均为阴性，说明提取物中无甾醇类化合物；醋酸纤维薄膜电泳：硼酸缓冲液0.2 mol/L，pH=9.2，醋酸纤维薄膜（3 cm×10 cm）载体，3%阿利新蓝醋酸溶液作显色剂，电压340 V，时间40 min，均为单一蓝色色带向负极方向泳动。可确定白色粉末为较纯桑白皮多糖。
本试验利用超声法提取多糖相对其他方法有较大的优势：提取时间缩短，提取率随之提高；提取过程无须加热，避免桑白皮多糖的分解；所用仪器、试剂简单易得，操作方便，超声仪自动化程度高，便于大规模工业化生产。因为超声提取时间过长，可能导致多糖分子结构发生变化，糖链断裂，使多糖提取含量下降，故本试验对超声提取时间进行了考察。
供试品制备时上大孔树脂，目的是除去桑白皮中其他非糖类化合物，提高多糖纯度，减少杂质对桑白皮多糖含量的测定。
目前国内对桑白皮多糖工艺方面的研究极少，笔者就超声提取进行研究分析，研究范围单一。因此，有必要对桑白皮多糖进行深入研究，尤其对提取工艺、分离方法等进行多组份对比试验研究，从而筛选出最优的提取、分离、纯化方案。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：280.
[2] 马松涛，王秋林，张效科.桑白皮提取物对实验性糖尿病神经病变的保护作用[J].中华中医药杂志，2006，21（12）：776-777.
[3] 孙静芸，徐宝林，张文娟.桑白皮平喘、利尿有效成分研究[J].中国中药杂志，2002，27（5）：366-367.
[4] 罗士德，J Nemec，宁冰梅.桑白皮中抗人HIV成分研究[J].云南植物研究，1995，17（1）：89-95.
（收稿日期：2012-03-10，编辑：陈静）