引言/目的牛肠道病毒(BEV)是近年来在我国部分牛场新发现的一种消化道病毒病病原。牛感染肠道病毒BEV后,表现为轻微下痢和呼吸道症状,食欲下降,严重者便血,产奶量大幅下降。因此,亟需建立针对BEV快速有效的检测方法。材料与方法针对BEV 3D基因的保守区设计引物,提取病毒RNA,反转录cDNA,并进行PCR扩增和电泳检测,凝胶回收PCR产物,克隆、测序,获得阳性标准品;以阳性标准品为模板,优化BEV SYBRGreen I荧光定量RT-PCR反应体系、反应条件,制作标准曲线,建立检测方法;采用该方法分别以牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒等病毒的cDNA/DNA为模板进行特异性实验;比较SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR法和RT-PCR方法的灵敏性;进行批内、批间的重复性试验,验证该荧光定量RT-PCR方法的重复性及稳定性;还对送检的41份疑似临床样品和3份气溶胶进行检测。结果与讨论通过对SYBR Green I实时荧光定量PCR条件进行优化,建立了最佳的反应体系与条件;BEV标准样品的溶解曲线为单一波峰,而其它病毒及阴性对照没有出现熔点峰,表明本方法特异性好。本方法检测BEV最低模板拷贝数为7.13,比RT-PCR高10倍;其批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于0.22%,重复性好。通过对送检样本进行检测,实时荧光定量PCR方法检出阳性率为43.18%,RT-PCR方法检出阳性率为38.64%。SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法与Northern blotting、竞争性PCR、RT-PCR半定量检测等传统的mRNA定量方法技术相比,具有操作简便、快速高效的特点,且灵敏度和特异性更高;与TaqMan荧光定量PCR相比,无需设计和优化荧光探针,价格便宜,适用性好,更适于临床样本检测。结论本研究建立的SYBRGreen I实时荧光定量RT-PCR检测方法具有特异、稳定、高效的优点,既可以用于临床检测,又可对环境中的BEV进行动态监测,为BEV流行病学调查、诊断提供了有力的技术支持。