奶牛乳房炎是兽医临床的常见病。病原菌为主要致病因素,金葡菌是重要病原菌之一,其诱发的乳房炎反复发作,迁延不愈,究其原因,可能与金葡菌能形成生物被膜或入侵乳腺上皮细胞,以逃避抗菌药物和免疫系统的杀灭有关。目前奶牛乳房炎的防治仍以乳房注入抗菌药物为主,但医学临床发现亚抑菌浓度下的抗菌药物能促进或抑制金葡菌形成生物被膜和入侵乳腺上皮细胞,影响预后。因此,本试验以奶牛乳房炎源金葡菌为研究对象,探究亚抑菌浓度的利福昔明、3种精油（桉叶油、鱼腥草油和薄荷油）单独或联合对其形成生物被膜和入侵MAC-T细胞的作用。首先,测定利福昔明、3种精油单独或联合对金葡菌的体外抑菌作用,然后研究其对强成膜株被膜形成的干预和成熟被膜的消除作用,进而建立细菌细胞共培养模型,考察利福昔明和薄荷油对金葡菌入侵MAC-T细胞的影响及胞内杀菌作用,并初步探究对被膜相关基因的影响,为临床合理应用药物有效防控金葡菌感染提供理论依据。1利福昔明、3种精油单独或联合的体外抑菌作用评价微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。利福昔明对标准菌株的MIC为0.016μg·mL-1,对9株临床分离株的MICs范围为0.016～4.00 μg·mL-1,具有良好的抑菌活性;3种精油中,薄荷油的抑菌效果较强,对标准菌株的MIC为0.63%,对9株临床分离株的MICs范围为0.16%～2.50%。棋盘法测定联合抑菌指数（FICI）。利福昔明与薄荷油联合对10株金葡菌均表现为相加作用,与桉叶油、鱼腥草油联合对大部分金葡菌表现为无关作用。2利福昔明、3种精油单独或联合对金葡菌形成生物被膜的影响结晶紫染色法检测被膜形成能力,筛选强成膜株。10株受试金葡菌均能形成生物被膜,其中标准菌株具有强成膜能力,临床分离株中,3株具有弱成膜能力,1株具有中等成膜能力,5株具有强成膜能力。选择临床分离株中成膜能力最强的2、4和9号菌进一步试验。结晶紫染色法检测利福昔明、精油对生物被膜形成的干预能力及对成熟生物被膜的消除作用,结果如下:1/2 MIC利福昔明、一定浓度的3种精油单独处理,对3株菌的被膜形成均有抑制作用（P＜0.01）;利福昔明与1/2 MIC桉叶油、1/2 MIC鱼腥草油或1/8～1/2 MIC薄荷油联合处理,3株菌的被膜形成量均显著低于利福昔明单独处理（P＜0.05）。3种精油中,薄荷油单独或与利福昔明联合,均表现了更强的抑制作用,故选择利福昔明和薄荷油进一步试验。1/2 MIC利福昔明、1/8～1/2 MIC薄荷油单独或联合处理,均能显著消除3株菌的成熟生物被膜（P＜0.05）;联合组的消除率高于利福昔明组和同浓度薄荷油组。SEM镜检与结晶紫染色结果一致。通过荧光定量PCR（RT-PCR）从转录水平检测1/2 MIC利福昔明、1/8 MIC薄荷油对被膜干预和消除过程中被膜相关基因的作用。被膜干预时,利福昔明和薄荷油单独或联合对被膜相关基因cidA、icaA、clfA、fnbA均有极显著下调作用（P＜0.01）;被膜消除时,利福昔明单独处理,对cidA、icaA、fnbA有极显著的下调作用（P＜0.01）,薄荷油对icaA、clfA、fnbA有明显下调作用（P＜0.01）,联合处理对被膜相关基因均有极显著下调作用（P＜0.01）。3利福昔明和薄荷油对金葡菌入侵MAC-T细胞的影响噻唑蓝（MTT）检测细胞毒性。0.08和0.16 μg·mL-1利福昔明、0.02%薄荷油、100μg·mL-1庆大霉素处理奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）3h和24h,未表现出明显的细胞毒性,可用于后续试验。建立细菌细胞共培养模型,观察1/2MIC利福昔明、薄荷油对金葡菌入侵MAC-T细胞的影响。共培养模型中,感染复数（MOI,细菌/细胞）为100,共培养时间为3 h。利福昔明单独或联合薄荷油处理,能极显著抑制2、4或9号菌入侵MAC-T细胞（P＜0.01）;联合处理组的抑制作用强于单独组（P＜0.01）。利福昔明、薄荷油联合处理对MAC-T胞内的2或9号菌有极显著清除作用（P＜0.01）。通过荧光定量PCR（RT-PCR）从转录水平检测1/2 MIC利福昔明、0.02%薄荷油对被膜相关基因的作用。入侵干预过程中,利福昔明单独和联合对被膜相关基因都有极显著抑制作用（P＜0.01）;胞内杀菌过程中,利福昔明能极显著下调clfA、fnbA（P＜0.01）,两者联合显著下调icaA、clfA、fnbA（P＜0.05）。