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手性醇化合物在手性药物、食品香料、化学农药和液晶材料等领域发挥着重要的作用。生物法催化手性醇合成具有高对映体选择性、反应条件温和、反应溶剂绿色、可持续性等优点，受到了广泛的关注。然而，生物催化剂在催化反应过程中常面临稳定性较差和难回收等问题；另外，野生菌催化剂面临胞内酶系复杂，关键酶表达水平低和培养条件苛刻等问题，这在一定程度上限制了其应用。本课题组前期从土壤中筛选得到一株催化2-羟基苯乙酮(HAP)高对映体选择性还原合成(R)-1-苯基-1,2-乙二醇{(R)-PED}的KurthiagibosoniiSC0312菌株。在此基础上，本课题通过基因工程技术从具有自主知识产权的K.gibsoniiSC0312细胞中挖掘催化HAP不对称还原的关键羰基还原酶基因，构建具有辅因子再生功能的多酶纳米反应器和重组大肠杆菌反应系统，提升催化HAP不对还原合成(R)-PED的反应效率。
从KurthiagibsoniiSC0312细胞中预测8个关键羰基还原酶基因，采用基因工程技术将它们克隆在E.coliBL21(DE3)中并表达，分析重组大肠杆菌催化HAP还原的活性和对映体选择性，最终确定一个催化HAP高对映体选择性还原合成(R)-PED的关键酶KgBDH。该酶由349个氨基酸编码，为同源二聚体，分子量为37.5KDa，属于中链脱氢酶超家族，具有典型的辅酶结合基序和锌基序。酶学性质研究表明，重组KgBDH在pH6.0-8.0具有较好的活性，在45℃时酶活性最高。重组酶在pH7.5-8.0和温度20-30℃时表现出较好的稳定性。常见金属离子对重组KgBDH无激活作用。重组KgBDH在pH7.5和35℃条件下催化HAP还原的Km值，kcat值和酶比活力分别为5.4mmol/L，4.9s-1和6.7U/mg。
基于KgBDH，FDH(甲酸脱氢酶)和自组装系统SpyCatcher/SpyTag，构建具有辅因子再生功能和催化(R)-PED不对称合成的多酶纳米反应器。通过蛋白融合技术构建含自组装元件的融合酶KgBDH-SpyCatcher(KgBDH-SC)和FDH-SpyTag(FDH-ST)。在设定条件下，两个融合酶在体外自组装后，通过交联法固定在二氧化硅纳米粒子上得到共固定化酶KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2，其活性是传统随机共固定化酶的2.9倍且酶活性回收率为49%。KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在pH7.0-7.5和35℃时表现出较好的催化性能。与游离混合酶相比，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2表现出更好的pH稳定性和有机试剂稳定性。此外，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在重复使用8批次后活性仍保留52.5%。最后，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在磷酸缓冲液反应体系中可催化60mmol/LHAP不对称还原合成(R)-PED，产率和光学纯度分别为83.9%和>99%。
调控KgBDH-SC和FDH-ST与载体的固定化顺序，通过交联法和蛋白自组装可制备得到催化(R)-PED不对称合成的有序共固定化酶FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2。在最佳制备条件下，FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2的酶活回收率为50%。有序共固定化酶在pH7.0-7.5和35-40℃时具有较好的催化性能。与游离混合酶相比，有序共固定化酶具有更好的pH稳定性和有机试剂稳定性。此外，有序共固定化酶在催化HAP还原8批次后活性保留51.7%。最后，FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2在磷酸缓冲液体系中可催化80mmol/LHAP不对称还原合成(R)-PED，产率和光学纯度分别为87.4%和>99%。
通过将KgBDH和GDH(葡萄糖脱氢酶)在大肠杆菌工程菌中共表达，构建得到一株重组E.coliBL21(DE3)-pETduet1-KgBDH-GDH工程菌。该重组工程菌的最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.1mmol/L，温度20℃和时间18h。为提升游离细胞的稳定性，用活性炭-海藻酸钙复合材料包埋该重组大肠杆菌工程菌。研究发现，活性炭-海藻酸钙包埋的细胞催化HAP还原的活性显著高于海藻酸钙固定化细胞的，且与游离细胞的活性相当。活性炭-海藻酸钙固定化细胞催化HAP还原的最适pH为7.5，在pH6.0-9.0和温度25-30℃时具有较好的稳定性。另外，该固定化细胞催化HAP还原的操作稳定性优于游离细胞，其在重复使用4批次后活性保留55%。最后，通过底物分批流加，活性炭-海藻酸钙固定化细胞催化240mmol/LHAP不对称还原反应12h可合成195mmol/L(R)-PED，产率为81%，光学纯度大于99%。
从KurthiagibsoniiSC0312细胞中预测8个关键羰基还原酶基因，采用基因工程技术将它们克隆在E.coliBL21(DE3)中并表达，分析重组大肠杆菌催化HAP还原的活性和对映体选择性，最终确定一个催化HAP高对映体选择性还原合成(R)-PED的关键酶KgBDH。该酶由349个氨基酸编码，为同源二聚体，分子量为37.5KDa，属于中链脱氢酶超家族，具有典型的辅酶结合基序和锌基序。酶学性质研究表明，重组KgBDH在pH6.0-8.0具有较好的活性，在45℃时酶活性最高。重组酶在pH7.5-8.0和温度20-30℃时表现出较好的稳定性。常见金属离子对重组KgBDH无激活作用。重组KgBDH在pH7.5和35℃条件下催化HAP还原的Km值，kcat值和酶比活力分别为5.4mmol/L，4.9s-1和6.7U/mg。
基于KgBDH，FDH(甲酸脱氢酶)和自组装系统SpyCatcher/SpyTag，构建具有辅因子再生功能和催化(R)-PED不对称合成的多酶纳米反应器。通过蛋白融合技术构建含自组装元件的融合酶KgBDH-SpyCatcher(KgBDH-SC)和FDH-SpyTag(FDH-ST)。在设定条件下，两个融合酶在体外自组装后，通过交联法固定在二氧化硅纳米粒子上得到共固定化酶KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2，其活性是传统随机共固定化酶的2.9倍且酶活性回收率为49%。KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在pH7.0-7.5和35℃时表现出较好的催化性能。与游离混合酶相比，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2表现出更好的pH稳定性和有机试剂稳定性。此外，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在重复使用8批次后活性仍保留52.5%。最后，KgBDH-SC-ST-FDH-SiO2在磷酸缓冲液反应体系中可催化60mmol/LHAP不对称还原合成(R)-PED，产率和光学纯度分别为83.9%和>99%。
调控KgBDH-SC和FDH-ST与载体的固定化顺序，通过交联法和蛋白自组装可制备得到催化(R)-PED不对称合成的有序共固定化酶FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2。在最佳制备条件下，FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2的酶活回收率为50%。有序共固定化酶在pH7.0-7.5和35-40℃时具有较好的催化性能。与游离混合酶相比，有序共固定化酶具有更好的pH稳定性和有机试剂稳定性。此外，有序共固定化酶在催化HAP还原8批次后活性保留51.7%。最后，FDH-ST-SC-KgBDH@SiO2在磷酸缓冲液体系中可催化80mmol/LHAP不对称还原合成(R)-PED，产率和光学纯度分别为87.4%和>99%。
通过将KgBDH和GDH(葡萄糖脱氢酶)在大肠杆菌工程菌中共表达，构建得到一株重组E.coliBL21(DE3)-pETduet1-KgBDH-GDH工程菌。该重组工程菌的最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.1mmol/L，温度20℃和时间18h。为提升游离细胞的稳定性，用活性炭-海藻酸钙复合材料包埋该重组大肠杆菌工程菌。研究发现，活性炭-海藻酸钙包埋的细胞催化HAP还原的活性显著高于海藻酸钙固定化细胞的，且与游离细胞的活性相当。活性炭-海藻酸钙固定化细胞催化HAP还原的最适pH为7.5，在pH6.0-9.0和温度25-30℃时具有较好的稳定性。另外，该固定化细胞催化HAP还原的操作稳定性优于游离细胞，其在重复使用4批次后活性保留55%。最后，通过底物分批流加，活性炭-海藻酸钙固定化细胞催化240mmol/LHAP不对称还原反应12h可合成195mmol/L(R)-PED，产率为81%，光学纯度大于99%。