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炎症性疼痛(Inflammatory pain)是临床面临的重要问题。局部炎症可导致组织损伤和疼痛，例如促炎症介质如前列腺素、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、神经肽和生长因子在炎症局部释放，致使伤害性感受神经元敏感化。在临床上，因为电针治疗炎症性疼痛有显著效果，而应用广泛。之前有许多研究表明，电针可通过抑制许多炎症相关因子如IL-1β(Interleukin-1β)、iNOS(Inducible nitric oxide synthetase)和TNF-α(Tumornecrosisfactor-α)等来缓解炎症痛，但是具体的调控机制仍然有需要进一步研究。
AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase)作为能量代谢调节的关键分子，且激活AMPK还可以抑制多种不同的促炎信号级联。近年来，很多研究表明激活AMPK对炎性疼痛和神经病理性疼痛等都有显著的改善作用，说明AMPK是参与镇痛的重要靶点。另外有研究表明电针可激活AMPK发挥治疗作用，如改善心肌缺血等。那么，电针是否通过激活AMPK来缓解炎症性疼痛目前尚不清楚。
我们知道炎症刺激后活化的巨噬细胞会释放大量炎症因子如IL-1β等来介导疼痛发生。同时，在炎症状态下NF-κB(nuclear factor kappa-B)作为重要的转录调控因子可调控炎症因子的表达。在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)诱导的炎症性疼痛中，AMPK活化是否通过调控局部炎症皮肤组织巨噬细胞的NF-κB核转位来抑制IL-1β的表达从而缓解炎症痛，目前未见相关报道。
另外，炎症状态下活化巨噬细胞大量产生iNOS及其催化底物合成的一氧化氮也是介导外周感觉神经元痛觉敏化的重要原因。炎症刺激巨噬细胞后，STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3 )进入细胞核，p-STAT3(Ser727)在细胞核可促进iNOS的表达。那么，在CFA诱导的炎症痛模型中，激活AMPK是否调控STAT3核转位以及p-STAT3(Ser727)磷酸化参与缓解炎症痛，也有待研究。
本研究采用CFA诱导的炎症性疼痛模型，首先研究电针治疗炎症痛是否通过激活AMPK来抑制IL-1β和iNOS表达参与缓解炎症镇痛；然后使用野生型小鼠和CX3CR1-GFP转基因小鼠，给予CFA诱导的炎症痛模型以AMPK激动剂、拮抗剂、IL-1ra和AMPKshRNA干扰处理，明确激活AMPK是否通过抑制NF-κB在巨噬细胞核转位来减少IL-1β表达参与缓解炎症痛；最后采用CFA诱导的炎症痛模型，予AMPK激动剂和拮抗剂等处理，结合细胞实验，明确激活AMPK是否通过调控巨噬细胞的STAT3核转位和STAT3(Ser727)磷酸化、抑制iNOS表达等参与缓解炎症痛。本研究明确了电针激活AMPK缓解炎症痛的新机制。
第一部分电针激活AMPK抑制iNOS和IL-1β缓解炎症痛的研究
目的：采用CFA诱导炎症痛模型，给予电针治疗，观察电针对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响，以及电针对AMPK活化、IL-1β和iNOS表达的影响。给予AMPK拮抗剂CompoundC观察其对电针镇痛的影响。
方法：(1)在小鼠左后足底皮下注射CFA诱导炎症痛模型，采用痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，采用双足承重实验检测双足平衡状态。(2)CFA诱导炎症痛模型后的第2到第7天每天进行一次电针治疗，电针后检测痛行为学变化。(3)Westernblot(WB)实验检测局部炎症皮肤组织中AMPK活化(即AMPK的Thr172位点磷酸化)和总蛋白AMPK的水平变化。(4)WB和qPCR实验检测IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白水平变化。(5)在电针前0.5小时腹腔注射AMPK拮抗剂CompoundC，观察其对电针镇痛效果的影响。
结果：(1)在CFA诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解CFA导致的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)电针可进一步激活局部炎症皮肤组织的AMPK，同时可抑制CFA导致的IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白高表达。(3)在CFA诱导炎症痛模型中，造模后第2到第7天在电针前给予AMPK拮抗剂CompoundC抑制了电针的镇痛作用。(4)电针治疗结束后，观察到CompoundC可抑制电针激活AMPK的作用，同时逆转了电针对IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白抑制作用，免疫荧光观察IL-1β和iNOS与巨噬细胞共标。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解炎症痛，同时可激活AMPK，抑制iNOS和IL-1β的高表达。(2)本研究表明，电针激活AMPK治疗CFA诱导炎症痛的机制是电针激活局部炎症皮肤组织的AMPK抑制巨噬细胞iNOS和IL-1β高表达，从而抗炎镇痛。
第二部分AMPK活化通过抑制NF-κB活化和IL-1β表达缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，阐明在局部炎症皮肤组织激活AMPK，调控巨噬细胞NF-κB核转位和IL-1β表达的镇痛机制。
方法：(1)局部注射CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型，通过疼痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)CFA诱导的炎症痛模型后第4天，在炎症局部给予不同剂量的AMPK激活剂AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside)，检测AICAR对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的改善情况。(3)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织AMPK的激活情况，H&E染色观察局部炎症皮肤组织的炎症程度。(4)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织pro-IL-1β和IL-1βp17(剪切体，活化片段)表达水平的影响。(5)免疫荧光检测AICAR对局部炎症皮肤组织中巨噬细胞(CD68+)的NF-κBp65入核情况，同时观察巨噬细胞与p-AMPK的共标情况。(6)在CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型中，局部给予不同剂量的IL-1ra，观察IL-1ra对机械痛超敏和热痛过敏的改善作用。(7)CFA造模后第4天，在AICAR处理前给予AMPK的拮抗剂CompoundC预处理，观察CompoundC对AICAR镇痛效果的影响，WB检测AMPK活化、pro-IL-1β和IL-1β表达的变化。(8)在CFA诱导的炎症痛模型中采用AMPKα的shRNA慢病毒干扰AMPKα表达，然后给予AICAR局部处理，再观察干扰AMPKα后对痛行为学的影响，WB检测shRNA慢病毒干扰AMPKα的效果。(9)CFA诱导CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型，采用免疫荧光观察p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)共标情况，观察NF-κBp65在巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的入核变化，观察CX3CR1-GFP与CD68共标情况。
结果：(1)CFA可显著诱导小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。AICAR以剂量依赖方式显著缓解CFA诱导炎症痛模型小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏；同时显著激活局部炎症皮肤组织的AMPK。(2)CFA可显著增加小鼠局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17表达水平；给予AICAR可显著抑制CFA诱导的局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17的高水平表达。(3)免疫荧光结果显示，CFA可显著促进小鼠局部炎症皮肤组织中巨噬细胞的NF-κB入核，而AICAR可显著抑制CFA诱导的NF-κBp65在巨噬细胞的入核。同时，观察到巨噬细胞(CD68+)与p-AMPK的共标。(4)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，IL-1ra以剂量依赖方式显著改善小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，缓解疼痛。(5)AMPK的拮抗剂CompoundC可抑制AICAR缓解疼痛的作用。在AICAR给药前给予CompoundC预处理可抑制AICAR的镇痛作用，同时CompoundC可抑制AICAR激活AMPK的作用。(6)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，AICAR给药前给予CompoundC预处理可减弱AICAR抑制proIL-1β和IL-1βp17表达的作用。(7)AMPKαshRNA慢病毒干扰CFA诱导炎症局部的AMPKα表达，同时显著减弱AIACR的镇痛作用。(8)CFA诱导的CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型中，观察到p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的共标，以及CX3CR1-GFP与CD68的共标。AICAR给药前给予CompoundC预处理，可减弱AICAR抑制NF-κBp65进入巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)细胞核的作用。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型小鼠中，本研究通过在体实验表明CFA可诱导局部炎症皮肤组织中巨噬细胞NF-κBp65入核介导炎症细胞因子IL-1β的表达。(2)本研究表明激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是AMPK活化抑制了巨噬细胞(CD68+和CX3CR1-GFP+)的NF-κBp65入核的转录活性，减少了炎症因子IL-1β的表达。
第三部分AMPK活化调控STAT3核转位和STAT3Ser727磷酸化缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，观察AICAR的镇痛作用，及其对STAT3核转位、STAT3(Ser727)磷酸化和iNOS表达的影响。离体实验中，进一步阐明激活AMPK对STAT3核转位和p-STAT3(Ser727)调控及其参与抗炎镇痛的机制。
方法：(1)小鼠在CFA诱导炎症痛模型后第7天局部给予AMPK激动剂AICAR处理，观察AICAR对痛行为学的影响。(2)采用WB实验观察AICAR对局部炎症皮肤组织中p-AMPK、iNOS、p-STAT3(Ser727)和STAT3表达水平的影响。(3)采用WB实验观察浆核分离蛋白中STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达水平变化。采用免疫荧光标记实验观察STAT3和p-STAT3(Ser727)在局部炎症皮肤组织巨噬细胞中的浆核分布情况。(4)采用CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，然后给予CompoundC和AICAR处理，采用WB实验观察STAT3、p-STAT3(Ser727)和iNOS的表达水平变化。(5)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，WB实验检测CompoundC和AICAR对STAT3和p-STAT3(Ser727)在浆核中的表达变化，免疫荧光实验观察CompoundC和AICAR处理后STAT3和p-STAT3(Ser727)浆核分布情况。(6)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，CompoundC和AICAR处理后，采用流式细胞术检测ROS(reactive oxygen species)蓄积和线粒体损伤的情况。(7)把STAT3Ser727位点突变为天冬氨酸(Asp)((STAT3 S727D)使位点持续磷酸化，转染到NR8383巨噬细胞，采用流式细胞术观察STAT3S727D对CFA诱导巨噬细胞的ROS蓄积和线粒体损伤的影响。
结果：(1)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，局部AICAR处理可缓解疼痛，显著激活AMPK，增加了p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平，同时抑制了iNOS的高表达。(2)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，CFA可导致局部炎症皮肤组织巨噬细胞中STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平增加；而局部给予AICAR处理可抑制STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，还可促进STAT3(Ser727)的磷酸化，主要在胞浆的磷酸化。(3)在离体实验中，CFA诱导了NR8383巨噬细胞的iNOS高表达。激活AMPK可抑制iNOS高表达，同时可促进p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平升高。(4)CFA诱导了NR8383巨噬细胞STAT3核转位，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平升高；激活AMPK可抑制STAT3入核，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，同时促进了p-STAT3(Ser727)在巨噬细胞胞浆的磷酸化水平升高。(5)CFA诱导的NR8383巨噬细胞中，损伤线粒体增多，ROS蓄积水平增加；当激活AMPK后可抑制ROS的蓄积，同时缓解了巨噬细胞线粒体损伤。(6)STAT3S727D缓解了CFA诱导的巨噬细胞ROS蓄积和巨噬细胞线粒体损伤。
结论：(1)本研究探讨AMPK活化对p-STAT3(Ser727)的调控机制。AICAR激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是通过抑制巨噬细胞STAT3的入核，同时细胞核p-STAT3(Ser727)下降，iNOS的表达减少。(2)激活AMPK促进了STAT3(Ser727)的磷酸化，主要是在巨噬细胞胞浆的磷酸化，进而缓解CFA导致的巨噬细胞ROS蓄积和线粒体损伤，参与抗炎镇痛。
炎症性疼痛(Inflammatory pain)是临床面临的重要问题。局部炎症可导致组织损伤和疼痛，例如促炎症介质如前列腺素、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、神经肽和生长因子在炎症局部释放，致使伤害性感受神经元敏感化。在临床上，因为电针治疗炎症性疼痛有显著效果，而应用广泛。之前有许多研究表明，电针可通过抑制许多炎症相关因子如IL-1β(Interleukin-1β)、iNOS(Inducible nitric oxide synthetase)和TNF-α(Tumornecrosisfactor-α)等来缓解炎症痛，但是具体的调控机制仍然有需要进一步研究。
AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase)作为能量代谢调节的关键分子，且激活AMPK还可以抑制多种不同的促炎信号级联。近年来，很多研究表明激活AMPK对炎性疼痛和神经病理性疼痛等都有显著的改善作用，说明AMPK是参与镇痛的重要靶点。另外有研究表明电针可激活AMPK发挥治疗作用，如改善心肌缺血等。那么，电针是否通过激活AMPK来缓解炎症性疼痛目前尚不清楚。
我们知道炎症刺激后活化的巨噬细胞会释放大量炎症因子如IL-1β等来介导疼痛发生。同时，在炎症状态下NF-κB(nuclear factor kappa-B)作为重要的转录调控因子可调控炎症因子的表达。在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)诱导的炎症性疼痛中，AMPK活化是否通过调控局部炎症皮肤组织巨噬细胞的NF-κB核转位来抑制IL-1β的表达从而缓解炎症痛，目前未见相关报道。
另外，炎症状态下活化巨噬细胞大量产生iNOS及其催化底物合成的一氧化氮也是介导外周感觉神经元痛觉敏化的重要原因。炎症刺激巨噬细胞后，STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3 )进入细胞核，p-STAT3(Ser727)在细胞核可促进iNOS的表达。那么，在CFA诱导的炎症痛模型中，激活AMPK是否调控STAT3核转位以及p-STAT3(Ser727)磷酸化参与缓解炎症痛，也有待研究。
本研究采用CFA诱导的炎症性疼痛模型，首先研究电针治疗炎症痛是否通过激活AMPK来抑制IL-1β和iNOS表达参与缓解炎症镇痛；然后使用野生型小鼠和CX3CR1-GFP转基因小鼠，给予CFA诱导的炎症痛模型以AMPK激动剂、拮抗剂、IL-1ra和AMPKshRNA干扰处理，明确激活AMPK是否通过抑制NF-κB在巨噬细胞核转位来减少IL-1β表达参与缓解炎症痛；最后采用CFA诱导的炎症痛模型，予AMPK激动剂和拮抗剂等处理，结合细胞实验，明确激活AMPK是否通过调控巨噬细胞的STAT3核转位和STAT3(Ser727)磷酸化、抑制iNOS表达等参与缓解炎症痛。本研究明确了电针激活AMPK缓解炎症痛的新机制。
第一部分电针激活AMPK抑制iNOS和IL-1β缓解炎症痛的研究
目的：采用CFA诱导炎症痛模型，给予电针治疗，观察电针对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响，以及电针对AMPK活化、IL-1β和iNOS表达的影响。给予AMPK拮抗剂CompoundC观察其对电针镇痛的影响。
方法：(1)在小鼠左后足底皮下注射CFA诱导炎症痛模型，采用痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，采用双足承重实验检测双足平衡状态。(2)CFA诱导炎症痛模型后的第2到第7天每天进行一次电针治疗，电针后检测痛行为学变化。(3)Westernblot(WB)实验检测局部炎症皮肤组织中AMPK活化(即AMPK的Thr172位点磷酸化)和总蛋白AMPK的水平变化。(4)WB和qPCR实验检测IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白水平变化。(5)在电针前0.5小时腹腔注射AMPK拮抗剂CompoundC，观察其对电针镇痛效果的影响。
结果：(1)在CFA诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解CFA导致的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)电针可进一步激活局部炎症皮肤组织的AMPK，同时可抑制CFA导致的IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白高表达。(3)在CFA诱导炎症痛模型中，造模后第2到第7天在电针前给予AMPK拮抗剂CompoundC抑制了电针的镇痛作用。(4)电针治疗结束后，观察到CompoundC可抑制电针激活AMPK的作用，同时逆转了电针对IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白抑制作用，免疫荧光观察IL-1β和iNOS与巨噬细胞共标。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解炎症痛，同时可激活AMPK，抑制iNOS和IL-1β的高表达。(2)本研究表明，电针激活AMPK治疗CFA诱导炎症痛的机制是电针激活局部炎症皮肤组织的AMPK抑制巨噬细胞iNOS和IL-1β高表达，从而抗炎镇痛。
第二部分AMPK活化通过抑制NF-κB活化和IL-1β表达缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，阐明在局部炎症皮肤组织激活AMPK，调控巨噬细胞NF-κB核转位和IL-1β表达的镇痛机制。
方法：(1)局部注射CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型，通过疼痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)CFA诱导的炎症痛模型后第4天，在炎症局部给予不同剂量的AMPK激活剂AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside)，检测AICAR对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的改善情况。(3)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织AMPK的激活情况，H&E染色观察局部炎症皮肤组织的炎症程度。(4)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织pro-IL-1β和IL-1βp17(剪切体，活化片段)表达水平的影响。(5)免疫荧光检测AICAR对局部炎症皮肤组织中巨噬细胞(CD68+)的NF-κBp65入核情况，同时观察巨噬细胞与p-AMPK的共标情况。(6)在CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型中，局部给予不同剂量的IL-1ra，观察IL-1ra对机械痛超敏和热痛过敏的改善作用。(7)CFA造模后第4天，在AICAR处理前给予AMPK的拮抗剂CompoundC预处理，观察CompoundC对AICAR镇痛效果的影响，WB检测AMPK活化、pro-IL-1β和IL-1β表达的变化。(8)在CFA诱导的炎症痛模型中采用AMPKα的shRNA慢病毒干扰AMPKα表达，然后给予AICAR局部处理，再观察干扰AMPKα后对痛行为学的影响，WB检测shRNA慢病毒干扰AMPKα的效果。(9)CFA诱导CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型，采用免疫荧光观察p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)共标情况，观察NF-κBp65在巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的入核变化，观察CX3CR1-GFP与CD68共标情况。
结果：(1)CFA可显著诱导小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。AICAR以剂量依赖方式显著缓解CFA诱导炎症痛模型小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏；同时显著激活局部炎症皮肤组织的AMPK。(2)CFA可显著增加小鼠局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17表达水平；给予AICAR可显著抑制CFA诱导的局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17的高水平表达。(3)免疫荧光结果显示，CFA可显著促进小鼠局部炎症皮肤组织中巨噬细胞的NF-κB入核，而AICAR可显著抑制CFA诱导的NF-κBp65在巨噬细胞的入核。同时，观察到巨噬细胞(CD68+)与p-AMPK的共标。(4)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，IL-1ra以剂量依赖方式显著改善小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，缓解疼痛。(5)AMPK的拮抗剂CompoundC可抑制AICAR缓解疼痛的作用。在AICAR给药前给予CompoundC预处理可抑制AICAR的镇痛作用，同时CompoundC可抑制AICAR激活AMPK的作用。(6)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，AICAR给药前给予CompoundC预处理可减弱AICAR抑制proIL-1β和IL-1βp17表达的作用。(7)AMPKαshRNA慢病毒干扰CFA诱导炎症局部的AMPKα表达，同时显著减弱AIACR的镇痛作用。(8)CFA诱导的CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型中，观察到p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的共标，以及CX3CR1-GFP与CD68的共标。AICAR给药前给予CompoundC预处理，可减弱AICAR抑制NF-κBp65进入巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)细胞核的作用。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型小鼠中，本研究通过在体实验表明CFA可诱导局部炎症皮肤组织中巨噬细胞NF-κBp65入核介导炎症细胞因子IL-1β的表达。(2)本研究表明激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是AMPK活化抑制了巨噬细胞(CD68+和CX3CR1-GFP+)的NF-κBp65入核的转录活性，减少了炎症因子IL-1β的表达。
第三部分AMPK活化调控STAT3核转位和STAT3Ser727磷酸化缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，观察AICAR的镇痛作用，及其对STAT3核转位、STAT3(Ser727)磷酸化和iNOS表达的影响。离体实验中，进一步阐明激活AMPK对STAT3核转位和p-STAT3(Ser727)调控及其参与抗炎镇痛的机制。
方法：(1)小鼠在CFA诱导炎症痛模型后第7天局部给予AMPK激动剂AICAR处理，观察AICAR对痛行为学的影响。(2)采用WB实验观察AICAR对局部炎症皮肤组织中p-AMPK、iNOS、p-STAT3(Ser727)和STAT3表达水平的影响。(3)采用WB实验观察浆核分离蛋白中STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达水平变化。采用免疫荧光标记实验观察STAT3和p-STAT3(Ser727)在局部炎症皮肤组织巨噬细胞中的浆核分布情况。(4)采用CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，然后给予CompoundC和AICAR处理，采用WB实验观察STAT3、p-STAT3(Ser727)和iNOS的表达水平变化。(5)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，WB实验检测CompoundC和AICAR对STAT3和p-STAT3(Ser727)在浆核中的表达变化，免疫荧光实验观察CompoundC和AICAR处理后STAT3和p-STAT3(Ser727)浆核分布情况。(6)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，CompoundC和AICAR处理后，采用流式细胞术检测ROS(reactive oxygen species)蓄积和线粒体损伤的情况。(7)把STAT3Ser727位点突变为天冬氨酸(Asp)((STAT3 S727D)使位点持续磷酸化，转染到NR8383巨噬细胞，采用流式细胞术观察STAT3S727D对CFA诱导巨噬细胞的ROS蓄积和线粒体损伤的影响。
结果：(1)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，局部AICAR处理可缓解疼痛，显著激活AMPK，增加了p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平，同时抑制了iNOS的高表达。(2)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，CFA可导致局部炎症皮肤组织巨噬细胞中STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平增加；而局部给予AICAR处理可抑制STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，还可促进STAT3(Ser727)的磷酸化，主要在胞浆的磷酸化。(3)在离体实验中，CFA诱导了NR8383巨噬细胞的iNOS高表达。激活AMPK可抑制iNOS高表达，同时可促进p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平升高。(4)CFA诱导了NR8383巨噬细胞STAT3核转位，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平升高；激活AMPK可抑制STAT3入核，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，同时促进了p-STAT3(Ser727)在巨噬细胞胞浆的磷酸化水平升高。(5)CFA诱导的NR8383巨噬细胞中，损伤线粒体增多，ROS蓄积水平增加；当激活AMPK后可抑制ROS的蓄积，同时缓解了巨噬细胞线粒体损伤。(6)STAT3S727D缓解了CFA诱导的巨噬细胞ROS蓄积和巨噬细胞线粒体损伤。
结论：(1)本研究探讨AMPK活化对p-STAT3(Ser727)的调控机制。AICAR激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是通过抑制巨噬细胞STAT3的入核，同时细胞核p-STAT3(Ser727)下降，iNOS的表达减少。(2)激活AMPK促进了STAT3(Ser727)的磷酸化，主要是在巨噬细胞胞浆的磷酸化，进而缓解CFA导致的巨噬细胞ROS蓄积和线粒体损伤，参与抗炎镇痛。
AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase)作为能量代谢调节的关键分子，且激活AMPK还可以抑制多种不同的促炎信号级联。近年来，很多研究表明激活AMPK对炎性疼痛和神经病理性疼痛等都有显著的改善作用，说明AMPK是参与镇痛的重要靶点。另外有研究表明电针可激活AMPK发挥治疗作用，如改善心肌缺血等。那么，电针是否通过激活AMPK来缓解炎症性疼痛目前尚不清楚。
我们知道炎症刺激后活化的巨噬细胞会释放大量炎症因子如IL-1β等来介导疼痛发生。同时，在炎症状态下NF-κB(nuclear factor kappa-B)作为重要的转录调控因子可调控炎症因子的表达。在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)诱导的炎症性疼痛中，AMPK活化是否通过调控局部炎症皮肤组织巨噬细胞的NF-κB核转位来抑制IL-1β的表达从而缓解炎症痛，目前未见相关报道。
另外，炎症状态下活化巨噬细胞大量产生iNOS及其催化底物合成的一氧化氮也是介导外周感觉神经元痛觉敏化的重要原因。炎症刺激巨噬细胞后，STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3 )进入细胞核，p-STAT3(Ser727)在细胞核可促进iNOS的表达。那么，在CFA诱导的炎症痛模型中，激活AMPK是否调控STAT3核转位以及p-STAT3(Ser727)磷酸化参与缓解炎症痛，也有待研究。
本研究采用CFA诱导的炎症性疼痛模型，首先研究电针治疗炎症痛是否通过激活AMPK来抑制IL-1β和iNOS表达参与缓解炎症镇痛；然后使用野生型小鼠和CX3CR1-GFP转基因小鼠，给予CFA诱导的炎症痛模型以AMPK激动剂、拮抗剂、IL-1ra和AMPKshRNA干扰处理，明确激活AMPK是否通过抑制NF-κB在巨噬细胞核转位来减少IL-1β表达参与缓解炎症痛；最后采用CFA诱导的炎症痛模型，予AMPK激动剂和拮抗剂等处理，结合细胞实验，明确激活AMPK是否通过调控巨噬细胞的STAT3核转位和STAT3(Ser727)磷酸化、抑制iNOS表达等参与缓解炎症痛。本研究明确了电针激活AMPK缓解炎症痛的新机制。
第一部分电针激活AMPK抑制iNOS和IL-1β缓解炎症痛的研究
目的：采用CFA诱导炎症痛模型，给予电针治疗，观察电针对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响，以及电针对AMPK活化、IL-1β和iNOS表达的影响。给予AMPK拮抗剂CompoundC观察其对电针镇痛的影响。
方法：(1)在小鼠左后足底皮下注射CFA诱导炎症痛模型，采用痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，采用双足承重实验检测双足平衡状态。(2)CFA诱导炎症痛模型后的第2到第7天每天进行一次电针治疗，电针后检测痛行为学变化。(3)Westernblot(WB)实验检测局部炎症皮肤组织中AMPK活化(即AMPK的Thr172位点磷酸化)和总蛋白AMPK的水平变化。(4)WB和qPCR实验检测IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白水平变化。(5)在电针前0.5小时腹腔注射AMPK拮抗剂CompoundC，观察其对电针镇痛效果的影响。
结果：(1)在CFA诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解CFA导致的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)电针可进一步激活局部炎症皮肤组织的AMPK，同时可抑制CFA导致的IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白高表达。(3)在CFA诱导炎症痛模型中，造模后第2到第7天在电针前给予AMPK拮抗剂CompoundC抑制了电针的镇痛作用。(4)电针治疗结束后，观察到CompoundC可抑制电针激活AMPK的作用，同时逆转了电针对IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白抑制作用，免疫荧光观察IL-1β和iNOS与巨噬细胞共标。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解炎症痛，同时可激活AMPK，抑制iNOS和IL-1β的高表达。(2)本研究表明，电针激活AMPK治疗CFA诱导炎症痛的机制是电针激活局部炎症皮肤组织的AMPK抑制巨噬细胞iNOS和IL-1β高表达，从而抗炎镇痛。
第二部分AMPK活化通过抑制NF-κB活化和IL-1β表达缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，阐明在局部炎症皮肤组织激活AMPK，调控巨噬细胞NF-κB核转位和IL-1β表达的镇痛机制。
方法：(1)局部注射CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型，通过疼痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)CFA诱导的炎症痛模型后第4天，在炎症局部给予不同剂量的AMPK激活剂AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside)，检测AICAR对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的改善情况。(3)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织AMPK的激活情况，H&E染色观察局部炎症皮肤组织的炎症程度。(4)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织pro-IL-1β和IL-1βp17(剪切体，活化片段)表达水平的影响。(5)免疫荧光检测AICAR对局部炎症皮肤组织中巨噬细胞(CD68+)的NF-κBp65入核情况，同时观察巨噬细胞与p-AMPK的共标情况。(6)在CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型中，局部给予不同剂量的IL-1ra，观察IL-1ra对机械痛超敏和热痛过敏的改善作用。(7)CFA造模后第4天，在AICAR处理前给予AMPK的拮抗剂CompoundC预处理，观察CompoundC对AICAR镇痛效果的影响，WB检测AMPK活化、pro-IL-1β和IL-1β表达的变化。(8)在CFA诱导的炎症痛模型中采用AMPKα的shRNA慢病毒干扰AMPKα表达，然后给予AICAR局部处理，再观察干扰AMPKα后对痛行为学的影响，WB检测shRNA慢病毒干扰AMPKα的效果。(9)CFA诱导CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型，采用免疫荧光观察p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)共标情况，观察NF-κBp65在巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的入核变化，观察CX3CR1-GFP与CD68共标情况。
结果：(1)CFA可显著诱导小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。AICAR以剂量依赖方式显著缓解CFA诱导炎症痛模型小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏；同时显著激活局部炎症皮肤组织的AMPK。(2)CFA可显著增加小鼠局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17表达水平；给予AICAR可显著抑制CFA诱导的局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17的高水平表达。(3)免疫荧光结果显示，CFA可显著促进小鼠局部炎症皮肤组织中巨噬细胞的NF-κB入核，而AICAR可显著抑制CFA诱导的NF-κBp65在巨噬细胞的入核。同时，观察到巨噬细胞(CD68+)与p-AMPK的共标。(4)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，IL-1ra以剂量依赖方式显著改善小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，缓解疼痛。(5)AMPK的拮抗剂CompoundC可抑制AICAR缓解疼痛的作用。在AICAR给药前给予CompoundC预处理可抑制AICAR的镇痛作用，同时CompoundC可抑制AICAR激活AMPK的作用。(6)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，AICAR给药前给予CompoundC预处理可减弱AICAR抑制proIL-1β和IL-1βp17表达的作用。(7)AMPKαshRNA慢病毒干扰CFA诱导炎症局部的AMPKα表达，同时显著减弱AIACR的镇痛作用。(8)CFA诱导的CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型中，观察到p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的共标，以及CX3CR1-GFP与CD68的共标。AICAR给药前给予CompoundC预处理，可减弱AICAR抑制NF-κBp65进入巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)细胞核的作用。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型小鼠中，本研究通过在体实验表明CFA可诱导局部炎症皮肤组织中巨噬细胞NF-κBp65入核介导炎症细胞因子IL-1β的表达。(2)本研究表明激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是AMPK活化抑制了巨噬细胞(CD68+和CX3CR1-GFP+)的NF-κBp65入核的转录活性，减少了炎症因子IL-1β的表达。
第三部分AMPK活化调控STAT3核转位和STAT3Ser727磷酸化缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，观察AICAR的镇痛作用，及其对STAT3核转位、STAT3(Ser727)磷酸化和iNOS表达的影响。离体实验中，进一步阐明激活AMPK对STAT3核转位和p-STAT3(Ser727)调控及其参与抗炎镇痛的机制。
方法：(1)小鼠在CFA诱导炎症痛模型后第7天局部给予AMPK激动剂AICAR处理，观察AICAR对痛行为学的影响。(2)采用WB实验观察AICAR对局部炎症皮肤组织中p-AMPK、iNOS、p-STAT3(Ser727)和STAT3表达水平的影响。(3)采用WB实验观察浆核分离蛋白中STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达水平变化。采用免疫荧光标记实验观察STAT3和p-STAT3(Ser727)在局部炎症皮肤组织巨噬细胞中的浆核分布情况。(4)采用CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，然后给予CompoundC和AICAR处理，采用WB实验观察STAT3、p-STAT3(Ser727)和iNOS的表达水平变化。(5)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，WB实验检测CompoundC和AICAR对STAT3和p-STAT3(Ser727)在浆核中的表达变化，免疫荧光实验观察CompoundC和AICAR处理后STAT3和p-STAT3(Ser727)浆核分布情况。(6)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，CompoundC和AICAR处理后，采用流式细胞术检测ROS(reactive oxygen species)蓄积和线粒体损伤的情况。(7)把STAT3Ser727位点突变为天冬氨酸(Asp)((STAT3 S727D)使位点持续磷酸化，转染到NR8383巨噬细胞，采用流式细胞术观察STAT3S727D对CFA诱导巨噬细胞的ROS蓄积和线粒体损伤的影响。
结果：(1)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，局部AICAR处理可缓解疼痛，显著激活AMPK，增加了p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平，同时抑制了iNOS的高表达。(2)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，CFA可导致局部炎症皮肤组织巨噬细胞中STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平增加；而局部给予AICAR处理可抑制STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，还可促进STAT3(Ser727)的磷酸化，主要在胞浆的磷酸化。(3)在离体实验中，CFA诱导了NR8383巨噬细胞的iNOS高表达。激活AMPK可抑制iNOS高表达，同时可促进p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平升高。(4)CFA诱导了NR8383巨噬细胞STAT3核转位，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平升高；激活AMPK可抑制STAT3入核，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，同时促进了p-STAT3(Ser727)在巨噬细胞胞浆的磷酸化水平升高。(5)CFA诱导的NR8383巨噬细胞中，损伤线粒体增多，ROS蓄积水平增加；当激活AMPK后可抑制ROS的蓄积，同时缓解了巨噬细胞线粒体损伤。(6)STAT3S727D缓解了CFA诱导的巨噬细胞ROS蓄积和巨噬细胞线粒体损伤。
结论：(1)本研究探讨AMPK活化对p-STAT3(Ser727)的调控机制。AICAR激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是通过抑制巨噬细胞STAT3的入核，同时细胞核p-STAT3(Ser727)下降，iNOS的表达减少。(2)激活AMPK促进了STAT3(Ser727)的磷酸化，主要是在巨噬细胞胞浆的磷酸化，进而缓解CFA导致的巨噬细胞ROS蓄积和线粒体损伤，参与抗炎镇痛。
炎症性疼痛(Inflammatory pain)是临床面临的重要问题。局部炎症可导致组织损伤和疼痛，例如促炎症介质如前列腺素、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、神经肽和生长因子在炎症局部释放，致使伤害性感受神经元敏感化。在临床上，因为电针治疗炎症性疼痛有显著效果，而应用广泛。之前有许多研究表明，电针可通过抑制许多炎症相关因子如IL-1β(Interleukin-1β)、iNOS(Inducible nitric oxide synthetase)和TNF-α(Tumornecrosisfactor-α)等来缓解炎症痛，但是具体的调控机制仍然有需要进一步研究。
AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase)作为能量代谢调节的关键分子，且激活AMPK还可以抑制多种不同的促炎信号级联。近年来，很多研究表明激活AMPK对炎性疼痛和神经病理性疼痛等都有显著的改善作用，说明AMPK是参与镇痛的重要靶点。另外有研究表明电针可激活AMPK发挥治疗作用，如改善心肌缺血等。那么，电针是否通过激活AMPK来缓解炎症性疼痛目前尚不清楚。
我们知道炎症刺激后活化的巨噬细胞会释放大量炎症因子如IL-1β等来介导疼痛发生。同时，在炎症状态下NF-κB(nuclear factor kappa-B)作为重要的转录调控因子可调控炎症因子的表达。在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)诱导的炎症性疼痛中，AMPK活化是否通过调控局部炎症皮肤组织巨噬细胞的NF-κB核转位来抑制IL-1β的表达从而缓解炎症痛，目前未见相关报道。
另外，炎症状态下活化巨噬细胞大量产生iNOS及其催化底物合成的一氧化氮也是介导外周感觉神经元痛觉敏化的重要原因。炎症刺激巨噬细胞后，STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3 )进入细胞核，p-STAT3(Ser727)在细胞核可促进iNOS的表达。那么，在CFA诱导的炎症痛模型中，激活AMPK是否调控STAT3核转位以及p-STAT3(Ser727)磷酸化参与缓解炎症痛，也有待研究。
本研究采用CFA诱导的炎症性疼痛模型，首先研究电针治疗炎症痛是否通过激活AMPK来抑制IL-1β和iNOS表达参与缓解炎症镇痛；然后使用野生型小鼠和CX3CR1-GFP转基因小鼠，给予CFA诱导的炎症痛模型以AMPK激动剂、拮抗剂、IL-1ra和AMPKshRNA干扰处理，明确激活AMPK是否通过抑制NF-κB在巨噬细胞核转位来减少IL-1β表达参与缓解炎症痛；最后采用CFA诱导的炎症痛模型，予AMPK激动剂和拮抗剂等处理，结合细胞实验，明确激活AMPK是否通过调控巨噬细胞的STAT3核转位和STAT3(Ser727)磷酸化、抑制iNOS表达等参与缓解炎症痛。本研究明确了电针激活AMPK缓解炎症痛的新机制。
第一部分电针激活AMPK抑制iNOS和IL-1β缓解炎症痛的研究
目的：采用CFA诱导炎症痛模型，给予电针治疗，观察电针对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响，以及电针对AMPK活化、IL-1β和iNOS表达的影响。给予AMPK拮抗剂CompoundC观察其对电针镇痛的影响。
方法：(1)在小鼠左后足底皮下注射CFA诱导炎症痛模型，采用痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，采用双足承重实验检测双足平衡状态。(2)CFA诱导炎症痛模型后的第2到第7天每天进行一次电针治疗，电针后检测痛行为学变化。(3)Westernblot(WB)实验检测局部炎症皮肤组织中AMPK活化(即AMPK的Thr172位点磷酸化)和总蛋白AMPK的水平变化。(4)WB和qPCR实验检测IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白水平变化。(5)在电针前0.5小时腹腔注射AMPK拮抗剂CompoundC，观察其对电针镇痛效果的影响。
结果：(1)在CFA诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解CFA导致的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)电针可进一步激活局部炎症皮肤组织的AMPK，同时可抑制CFA导致的IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白高表达。(3)在CFA诱导炎症痛模型中，造模后第2到第7天在电针前给予AMPK拮抗剂CompoundC抑制了电针的镇痛作用。(4)电针治疗结束后，观察到CompoundC可抑制电针激活AMPK的作用，同时逆转了电针对IL-1β和iNOS的mRNA和蛋白抑制作用，免疫荧光观察IL-1β和iNOS与巨噬细胞共标。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型中，电针可显著缓解炎症痛，同时可激活AMPK，抑制iNOS和IL-1β的高表达。(2)本研究表明，电针激活AMPK治疗CFA诱导炎症痛的机制是电针激活局部炎症皮肤组织的AMPK抑制巨噬细胞iNOS和IL-1β高表达，从而抗炎镇痛。
第二部分AMPK活化通过抑制NF-κB活化和IL-1β表达缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，阐明在局部炎症皮肤组织激活AMPK，调控巨噬细胞NF-κB核转位和IL-1β表达的镇痛机制。
方法：(1)局部注射CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型，通过疼痛行为学实验检测小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。(2)CFA诱导的炎症痛模型后第4天，在炎症局部给予不同剂量的AMPK激活剂AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside)，检测AICAR对机械痛觉超敏和热痛觉过敏的改善情况。(3)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织AMPK的激活情况，H&E染色观察局部炎症皮肤组织的炎症程度。(4)WB检测AICAR对局部炎症皮肤组织pro-IL-1β和IL-1βp17(剪切体，活化片段)表达水平的影响。(5)免疫荧光检测AICAR对局部炎症皮肤组织中巨噬细胞(CD68+)的NF-κBp65入核情况，同时观察巨噬细胞与p-AMPK的共标情况。(6)在CFA诱导小鼠炎症性疼痛模型中，局部给予不同剂量的IL-1ra，观察IL-1ra对机械痛超敏和热痛过敏的改善作用。(7)CFA造模后第4天，在AICAR处理前给予AMPK的拮抗剂CompoundC预处理，观察CompoundC对AICAR镇痛效果的影响，WB检测AMPK活化、pro-IL-1β和IL-1β表达的变化。(8)在CFA诱导的炎症痛模型中采用AMPKα的shRNA慢病毒干扰AMPKα表达，然后给予AICAR局部处理，再观察干扰AMPKα后对痛行为学的影响，WB检测shRNA慢病毒干扰AMPKα的效果。(9)CFA诱导CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型，采用免疫荧光观察p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)共标情况，观察NF-κBp65在巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的入核变化，观察CX3CR1-GFP与CD68共标情况。
结果：(1)CFA可显著诱导小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。AICAR以剂量依赖方式显著缓解CFA诱导炎症痛模型小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏；同时显著激活局部炎症皮肤组织的AMPK。(2)CFA可显著增加小鼠局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17表达水平；给予AICAR可显著抑制CFA诱导的局部炎症皮肤组织的proIL-1β和IL-1βp17的高水平表达。(3)免疫荧光结果显示，CFA可显著促进小鼠局部炎症皮肤组织中巨噬细胞的NF-κB入核，而AICAR可显著抑制CFA诱导的NF-κBp65在巨噬细胞的入核。同时，观察到巨噬细胞(CD68+)与p-AMPK的共标。(4)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，IL-1ra以剂量依赖方式显著改善小鼠的机械痛觉超敏和热痛觉过敏，缓解疼痛。(5)AMPK的拮抗剂CompoundC可抑制AICAR缓解疼痛的作用。在AICAR给药前给予CompoundC预处理可抑制AICAR的镇痛作用，同时CompoundC可抑制AICAR激活AMPK的作用。(6)在CFA诱导的炎症痛模型小鼠中，AICAR给药前给予CompoundC预处理可减弱AICAR抑制proIL-1β和IL-1βp17表达的作用。(7)AMPKαshRNA慢病毒干扰CFA诱导炎症局部的AMPKα表达，同时显著减弱AIACR的镇痛作用。(8)CFA诱导的CX3CR1-GFP转基因小鼠炎症痛模型中，观察到p-AMPK与巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)的共标，以及CX3CR1-GFP与CD68的共标。AICAR给药前给予CompoundC预处理，可减弱AICAR抑制NF-κBp65进入巨噬细胞(CX3CR1-GFP+)细胞核的作用。
结论：(1)在CFA可诱导的炎症痛模型小鼠中，本研究通过在体实验表明CFA可诱导局部炎症皮肤组织中巨噬细胞NF-κBp65入核介导炎症细胞因子IL-1β的表达。(2)本研究表明激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是AMPK活化抑制了巨噬细胞(CD68+和CX3CR1-GFP+)的NF-κBp65入核的转录活性，减少了炎症因子IL-1β的表达。
第三部分AMPK活化调控STAT3核转位和STAT3Ser727磷酸化缓解炎症痛的机制
目的：采用CFA诱导的炎症痛模型，观察AICAR的镇痛作用，及其对STAT3核转位、STAT3(Ser727)磷酸化和iNOS表达的影响。离体实验中，进一步阐明激活AMPK对STAT3核转位和p-STAT3(Ser727)调控及其参与抗炎镇痛的机制。
方法：(1)小鼠在CFA诱导炎症痛模型后第7天局部给予AMPK激动剂AICAR处理，观察AICAR对痛行为学的影响。(2)采用WB实验观察AICAR对局部炎症皮肤组织中p-AMPK、iNOS、p-STAT3(Ser727)和STAT3表达水平的影响。(3)采用WB实验观察浆核分离蛋白中STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达水平变化。采用免疫荧光标记实验观察STAT3和p-STAT3(Ser727)在局部炎症皮肤组织巨噬细胞中的浆核分布情况。(4)采用CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，然后给予CompoundC和AICAR处理，采用WB实验观察STAT3、p-STAT3(Ser727)和iNOS的表达水平变化。(5)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，WB实验检测CompoundC和AICAR对STAT3和p-STAT3(Ser727)在浆核中的表达变化，免疫荧光实验观察CompoundC和AICAR处理后STAT3和p-STAT3(Ser727)浆核分布情况。(6)CFA诱导NR8383巨噬细胞炎症反应，CompoundC和AICAR处理后，采用流式细胞术检测ROS(reactive oxygen species)蓄积和线粒体损伤的情况。(7)把STAT3Ser727位点突变为天冬氨酸(Asp)((STAT3 S727D)使位点持续磷酸化，转染到NR8383巨噬细胞，采用流式细胞术观察STAT3S727D对CFA诱导巨噬细胞的ROS蓄积和线粒体损伤的影响。
结果：(1)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，局部AICAR处理可缓解疼痛，显著激活AMPK，增加了p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平，同时抑制了iNOS的高表达。(2)在CFA诱导炎症痛模型后第7天，CFA可导致局部炎症皮肤组织巨噬细胞中STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平增加；而局部给予AICAR处理可抑制STAT3进入细胞核，同时p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，还可促进STAT3(Ser727)的磷酸化，主要在胞浆的磷酸化。(3)在离体实验中，CFA诱导了NR8383巨噬细胞的iNOS高表达。激活AMPK可抑制iNOS高表达，同时可促进p-STAT3(Ser727)的磷酸化水平升高。(4)CFA诱导了NR8383巨噬细胞STAT3核转位，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平升高；激活AMPK可抑制STAT3入核，p-STAT3(Ser727)在细胞核水平下降，同时促进了p-STAT3(Ser727)在巨噬细胞胞浆的磷酸化水平升高。(5)CFA诱导的NR8383巨噬细胞中，损伤线粒体增多，ROS蓄积水平增加；当激活AMPK后可抑制ROS的蓄积，同时缓解了巨噬细胞线粒体损伤。(6)STAT3S727D缓解了CFA诱导的巨噬细胞ROS蓄积和巨噬细胞线粒体损伤。
结论：(1)本研究探讨AMPK活化对p-STAT3(Ser727)的调控机制。AICAR激活AMPK缓解CFA诱导炎症痛的机制是通过抑制巨噬细胞STAT3的入核，同时细胞核p-STAT3(Ser727)下降，iNOS的表达减少。(2)激活AMPK促进了STAT3(Ser727)的磷酸化，主要是在巨噬细胞胞浆的磷酸化，进而缓解CFA导致的巨噬细胞ROS蓄积和线粒体损伤，参与抗炎镇痛。