意大利青霉菌效应蛋白的鉴定及PiWSC1的功能分析

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由意大利青霉菌(Penicillium italicum)引起的柑橘采后青霉病,是导致柑橘果实采后腐烂的重要原因之一。病原菌与其宿主的相互作用是相对复杂的,介导致病性的因素尚未完全明确。效应蛋白是病原菌侵染宿主期间分泌的能够增强其致病力并且干扰宿主防御系统的一类蛋白,在植物与病原菌互作过程中起关键作用。本论文在已公布的意大利青霉菌基因组数据基础上,利用生物信息学技术以及RTq PCR筛选和鉴定意大利青霉菌效应蛋白,并通过分析核心候选效应基因Piwsc1缺失突变体的结构变化、生长特性和侵染过程中与宿主相互作用的表达模式,在分子水平上探究效应蛋白影响意大利青霉菌侵染柑橘的作用机制。主要结果如下:(1)意大利青霉菌效应蛋白的预测与筛选。结合常见的效应蛋白特征和意大利青霉菌侵染脐橙组织72 h的转录组数据,设计了一条预测意大利青霉菌候选效应蛋白库的管道。利用Signal P、Target P、TMHMM、Pred GPI等软件预测出375个意大利青霉菌分泌蛋白,其中部分(29.07%)具有碳水化合物酶活性,推测可能参与病原菌与宿主的相互作用过程。此外,通过预测管道进一步筛选出29个最佳候选效应蛋白,其中5个核心候选效应蛋白符合本研究设计的4个筛选标准。随机挑选的12个候选效应蛋白在PDA培养和意大利青霉菌侵染柑橘的早期阶段被高度诱导表达。(2)核心候选效应蛋白之一,细胞壁完整性和应力应答组分(Cell wall integrity and stress response component,WSC)相关蛋白Pi WSC1的功能分析。系统发育分析表明,Pi WSC1在不同青霉属和其他真菌属中具有高度保守性。在高渗透压、细胞壁干扰剂、氧化剂和热胁迫下,Piwsc1的转录水平均发生不同程度的下调。运用同源重组原理,构建Piwsc1基因的敲除菌株ΔPiwsc1、回补菌株ΔPiwsc1-co和过表达菌株OE-Piwsc1。对Piwsc1基因的各突变株进行微观形态、菌丝生长、产孢、环境胁迫、致病力等方面的研究发现:相较于野生型(Wild type,WT)意大利青霉菌,ΔPiwsc1的菌落生长直径在第7 d降低20.15%,菌落形态表现为菌丝稀疏,内部结构发生改变,OE-Piwsc1菌落生长直径升高8.22%,表型与WT无显著差异;ΔPiwsc1的产孢量降低35.31%,OE-Piwsc1升高38.76%;ΔPiwsc1的孢子萌发率降低22.27%,OEPiwsc1升高16.08%。在应对一些环境胁迫时,Piwsc1会起到一定作用。此外,Piwsc1的缺失使意大利青霉菌对柑橘果实致病力降低,病斑直径减少约50%。细胞壁降解酶活性的降低可能是导致ΔPiwsc1菌株侵染柑橘果实早期阶段致病力下降的原因。(3)利用双重RNA-seq分析效应蛋白Pi WSC1对意大利青霉菌与柑橘果实互作的影响。意大利青霉菌差异表达基因主要与细胞膜、活性氧代谢、细胞自噬与死亡以及MAPK信号转导通路等方面相关,柑橘果实差异表达基因主要与应激反应、次生代谢产物等方面有关。因此Piwsc1的缺失可能会破坏意大利青霉菌细胞结构进而导致自身生长受阻以及诱导植物防御反应如产生活性氧来限制意大利青霉菌的生长和次级代谢产物苯丙烷类物质转录水平上调表达,以增强柑橘防御系统。综上,在意大利青霉菌中共筛选到29个候选效应蛋白,其中核心效应蛋白Pi WSC1不仅影响意大利青霉菌生长发育和致病力,并且在意大利青霉菌侵染柑橘的早期阶段活跃表达,被柑橘识别引起防御反应。
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