乳腺癌(breast cancer)是引发脑转移(brain metastases，BM)的第二位实体恶性肿瘤。乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastases，BCBM)是乳腺癌最严重的并发症，是乳腺癌患者致死、致残的重要原因之一，它严重影响患者的认知、语言、动作协调性、行为及生活质量。目前缺乏脑转移性乳腺癌分子成像探针及有效抑制BCBM的分子靶向药物，开发靶向脑转移性乳腺癌的分子成像探针对BCBM早期诊断和高灵敏度探测具有重要意义，开发有效抑制BCBM的分子靶向药物对提高BCBM的治疗具有重要应用价值。　　在靶向分子不明确的情况下，本课题通过高通量的噬菌体展示肽库筛选技术筛选获得与脑转移性乳腺癌细胞系231-BR结合的多肽（命名为BRBP1），并将其应用于脑转移性乳腺癌荷瘤鼠体内近红外荧光成像及靶向药物递送研究。本课题主要包含以下内容:　　1.脑转移性乳腺癌细胞系结合多肽的筛选、序列测定及生物信息学分析　　目的:本部分旨在通过噬菌体展示肽库筛选技术获得与脑转移性乳腺癌细胞系特异性结合的多肽，并通过生物信息学分析预测候选肽段的理化性质和结构特征。　　方法:构建乳腺癌脑转移模型，通过小动物磁共振成像(micro-magnetic resonance imaging，Micro-MRI)、离体脑组织荧光成像及苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色鉴定231-BR细胞系脑转移潜能。以231-BR细胞为正筛细胞，亲代乳腺癌细胞MDA-MB-231为负筛细胞进行噬菌体展示肽库全细胞消减筛选。四轮筛选并获得有效富集后，噬菌体单克隆化，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)鉴定候选噬菌体-肽克隆细胞结合特异性。对P/N≥3的强阳性噬菌体-肽克隆进行序列测定及同源比对，并通过生物信息学方法分析预测候选肽段的理化性质和结构特征。　　结果:乳腺癌脑转移模型鼠Micro-MRI活体成像、离体脑组织荧光成像均检测到散发的、异常的乳腺癌脑转移灶信号，H&E染色进一步确证以上结果。以231-BR细胞系为靶细胞进行噬菌体展示肽库筛选，经过四轮筛选，与231-BR细胞结合的噬菌体克隆富集44倍，单克隆化120个噬菌体克隆，选取P/N≥3的22个候选噬菌体克隆测序，序列比对共计发现3种插入肽段序列，它们含有共同基序-PWTExxY-，其中BRBP1肽为优势序列（占72.8％）。生物信息学分析BRBP1肽的分子量为1487.6，理论等电点为4.00，由199个原子构成，分子式为C69Ha4N14O21S1，在哺乳动物网织红细胞半衰期约为30 h，不稳定系数为72.41，脂溶系数为32.50。　　结论:通过噬菌体展示肽库筛选技术获得了与脑转移性乳腺癌细胞系231-BR结合的候选多肽，可用于后续特异性鉴定及应用研究。　　2.脑转移性乳腺癌细胞结合多肽特异性鉴定　　目的:本部分旨在通过体内外实验鉴定候选噬菌体-肽克隆BRBP1-M13及其对应BRBP1肽与231-BR细胞系结合的特异性。鉴定BRBP1肽与人乳腺癌冰冻及石蜡组织标本结合的特异性并分析二者的结合状态与患者肿瘤分期、淋巴结转移等的相关性。　　方法:在噬菌体-肽水平，通过噬菌体-肽克隆与细胞浓度依赖性结合实验、竞争结合实验鉴定噬菌体-肽单克隆BRBP1-M13与231-BR细胞系结合特异性。构建乳腺癌皮下移植瘤模型，通过噬菌体免疫荧光染色鉴定BRBP1-M13噬菌体克隆与离体肿瘤组织结合特异性，通过噬菌体体内回输实验鉴定BRBP1-M13噬菌体克隆体内肿瘤靶向性及生物分布。BRBP1肽合成及荧光修饰后，通过免疫荧光染色鉴定BRBP1肽与231-BR细胞系结合的特异性、浓度依赖性、温度依赖性、孵育时间依赖性及内化情况。构建231-BR皮下移植瘤模型及乳腺癌脑转移模型，在离体组织水平鉴定BRBP1肽与皮下移植瘤组织及乳腺癌脑转移灶结合特异性。通过免疫荧光染色鉴定BRBP1肽与人乳腺癌冰冻及石蜡组织标本结合特异性并分析二者的结合状态与患者肿瘤分期、淋巴结转移等的相关性。通过免疫荧光双标染色实验鉴定BRBP1肽与基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)在人乳腺癌组织标本中共定位情况。　　结果:在噬菌体-肽水平，BRBP1-M13噬菌体克隆可与231-BR细胞高特异性结合，且这种特异性结合可被BRBP1肽竞争抑制。BRBP1-M13噬菌体克隆也可与231-BR皮下移植瘤离体肿瘤组织特异性结合。BRBP1-M13噬菌体克隆在231-BR荷瘤鼠体内肿瘤组织有效富集，正常对照组织分布较少。在多肽水平，BRBP1肽合成及荧光标记后可与231-BR细胞高特异性结合，未标记荧光的BRBP1肽可竞争荧光标记BRBP1肽与231-BR细胞的结合。BRBP1肽与231-BR细胞的结合呈现浓度依赖性及温度（能量）依赖性;延长孵育时间至2h，BRBP1肽可内化进入231-BR细胞。BRBP1肽可在离体肿瘤组织水平与231-BR皮下移植瘤及乳腺癌脑转移灶特异性结合。BRBP1肽也可与部分人乳腺浸润性导管癌冰冻及石蜡组织标本特异性结合，且BRBP1肽与人乳腺浸润性导管癌原发灶结合情况与患者淋巴结转移状态(P=0.044)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)状态(P=0.043)相关。BRBP1肽与MMP9在部分乳腺癌组织标本共定位。　　结论: BRBP1-M13噬菌体克隆及BRBP1肽可在细胞、离体肿瘤组织及荷瘤鼠体内水平与231-BR细胞特异性结合。BRBP1肽可与人乳腺浸润性导管癌组织标本特异性结合且倾向结合高转移潜能的肿瘤细胞。　　3.BRBP1肽用于荷瘤鼠近红外荧光成像的研究　　目的:本部分旨在构建BRBP1-K(Cy5.5)近红外荧光(near-infrared fluorophores，NIRF)成像分子探针，并研究该探针的细胞毒性、肿瘤靶向性及荷瘤鼠体内生物分布。　　方法:构建近红外荧光成像探针BRBP1-K(Cy5.5)，通过免疫荧光染色在体外细胞水平检测该探针的特异性。通过MTT实验检测该探针对正常细胞的毒性。通过荷瘤鼠活体近红外荧光成像、离体组织近红外荧光成像及肿瘤组织切片荧光分布评价该探针体内肿瘤靶向性。　　结果: BRBP1-K(Cy5.5)近红外荧光成像探针与231-BR细胞系特异性结合，且该探针对正常组织细胞无显著细胞毒性。将该探针尾静脉注射入荷瘤鼠体内，在肿瘤组织检测到明显的荧光信号分布。离体组织近红外荧光成像表明BRBP1-K(Cy5.5)探针在肿瘤组织信号强度远高于心、肺组织的荧光信号。肿瘤组织切片荧光信号检测发现BRBP1-K(Cy5.5)探针在肿瘤组织信号强度高于对照探针Control-K(Cy5.5)。　　结论:BRBP1肽可用于构建近红外荧光成像分子探针，该探针具有良好的肿瘤靶向性和较低的细胞毒性，可用于荷瘤鼠体内近红外荧光成像研究。　　4.BRBP1肽靶向递送促凋亡肽增强抗肿瘤作用的研究　　目的:本部分旨在构建及优化BRBP1-TAT-KLA复合肽，并通过体内外实验研究该复合肽对脑转移性乳腺癌生长及脑转移灶形成的抑制作用。　　方法:将BRBP1肽与细胞渗透肽TAT及促凋亡肽KLA连接，构建及优化BRBP1-TAT-KLA复合肽。在体外细胞水平，通过MTT实验检测该复合肽对肿瘤细胞增殖的影响，通过TUNEL染色及AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测BRBP1-TAT-KLA复合肽的促凋亡作用，通过Transwell实验检测该复合肽体外抑制肿瘤细胞迁移作用，通过激光共聚焦显微镜Z-stacks扫描观察BRBP1-TAT-KLA复合肽的细胞内化，通过透射电子显微镜检测复合肽BRBP1-TAT-KLA对细胞超微结构的影响，通过Western blot（蛋白质免疫印迹）检测231-BR细胞经BRBP1-TAT-KLA复合肽处理后Caspase9及Caspase3的激活情况。在荷瘤鼠体内水平，将荧光标记的BRBP1-TAT-KLA复合肽尾静脉注射入荷瘤鼠体内研究该复合肽肿瘤靶向性和生物分布，在231-BR皮下移植瘤模型鼠中检测BRBP1-TAT-KLA复合肽对肿瘤生长的抑制作用，在乳腺癌脑转移模型鼠中检测BRBP1-TAT-KLA复合肽对大、小乳腺癌脑转移灶形成的抑制作用，通过TUNEL染色鉴定该复合肽在荷瘤鼠体内对肿瘤细胞的促凋亡作用，通过H&E染色评价该复合肽体内细胞毒性。　　结果:在体外细胞水平，BRBP1-TAT-KLA复合肽可快速内化进入231-BR细胞，诱导线粒体损伤，活化Caspase9及Caspase3，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。在荷瘤鼠体内水平，BRBP1-TAT-KLA复合肽与非靶向性对照肽TAT-KLA相比，具有更好的肿瘤组织靶向性，该复合肽在231-BR皮下移植瘤模型鼠中可显著抑制肿瘤的生长，在乳腺癌脑转移模型鼠中可显著抑制大、小乳腺癌脑转移灶的形成且对正常组织器官无显著细胞毒性。　　结论:BRBP1肽可用于靶向递送促凋亡肽，BRBP1-TAT-KLA复合肽在体内外均具有显著抗肿瘤作用。　　本课题的研究结果有望为探索乳腺癌脑转移的机制提供新的切入点，为乳腺癌脑转移早期诊断、靶向治疗及疗效监测提供重要实验基础。