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【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的创伤性疾病,发病率随着我国经济的迅速发展逐年提高。虽然世界各国在脊髓损伤领域都已进行了大量的研究,但是针对脊髓损伤有效的治疗仍未取得突破性进展。现阶段脊髓损伤的治疗方案中最有研究前景的是细胞移植治疗,其中雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)和骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的应用最为广阔。本团队之前的研究已证实骨髓间充质干细胞在雪旺细胞诱导条件下,能够向神经元方向分化,但分化过程中的关键miRNA及相关通路尚不清楚。因此,本实验拟研究雪旺细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,并通过miRNA组学的方法获得骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的过程中差异表达的microRNA,并探讨microRNA靶基因和相关信号通路。【方法】本实验从Wistar大鼠股骨和胫骨中分离原代骨髓间充质干细胞,传至第3代,用流式细胞仪和分化实验鉴定。从双侧坐骨神经中分离原代雪旺细胞,传至3代,使用S-100免疫荧光染色鉴定所获得SCs纯度。用雪旺细胞条件培养基与正常培养基分别培养,设为雪旺细胞条件培养基诱导组(实验组)和对照组,对于使用雪旺细胞条件培养基(SCs-CM)诱导的骨髓间充质干细胞的神经元分化,实验中应用BMSC和SC的共培养。通过不同时间段成像观察雪旺细胞条件培养基中骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的变化过程。qRT-PCR检测实验组骨髓间充质干细胞中与神经标志物相关的相对mRNA表达,MicroRNA array用于分析差异microRNA的表达。GO(Gene Ontology),KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析进行生物信息学分析,确定miRNA靶基因的作用。【结果】从成年Wistar大鼠的股骨和胫骨中分离BMSCs,并将P3的未分化细胞用于流式细胞术实验以测试表面标志物(CD34,CD45和CD29和CD90)的表达。BMSC显示CD29和CD90的阳性表达。相反,BMSCs显然几乎对CD34,CD45等造血标记物呈阴性。用大鼠双侧坐骨神经分离SCs,用P3细胞进行S-100/DAPI免疫荧光染色鉴定。细胞的形态几乎是纺锤体类型,并且对于S100,95.7±0.8%的细胞是阳性的。通过不同时间段成像观察雪旺细胞条件培养基中骨髓间充质干细胞,显微镜下实验组中的骨髓间充质干细胞体逐渐收缩变亮,形成多个神经突,最终形态变为具有神经突的神经元样细胞。qRT-PCR检测显示,实验组骨髓间充质干细胞中巢蛋白(Nestin)mRNA表达从培养1-3 d开始上调,到3-7 d开始下调,与对照组相比微管相关蛋白2(MAP2)mRNA表达从培养1-7 d逐渐增加。诱导7 d后,MicroRNA array用于分析差异microRNA的表达,两组相比共发现有83个表达差异表达的miRNA,其中77个miRNAs表达上调,6个miRNAs表达下调,这些DE-miRNAs被用来找出目标基因,并进一步进行生物信息学分析。GO(Gene Ontology)分析表明,这些DE-miRNA靶基因富集于神经元发育、轴突发生的调节并对细胞增殖起正性调控作用。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析显示,Hippo,Wnt,TGF-β和Hedgehog信号通路是骨髓间充质干细胞向神经分化相关的潜在信号通路。【结论】在目前的研究中,SCs可诱导BMSCs分化为神经元样细胞。接下来,研究了miRNA在BMMSCs中诱导分化为神经元样细胞的表达谱,并获得了83个DE-miRNA。KEGG分析的结果显示,miRNA靶标的显着改变富含几种神经元分化相关途径,包括Hippo信号通路,Wnt信号通路,TGF-β信号通路和Hedgehog信号通路。实验成功对骨髓间充质干细胞在雪旺细胞诱导下分化神经元样细胞进行了miRNAs分析,进一步分析了骨髓间充质干细胞神经分化中的关键miRNA和通路,为将来应用联合细胞移植治疗神经系统疾病提供了理论基础。