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背景:对全世界女性所患肿瘤来说,乳腺癌的发病率最高,位居第一位,病死率位居第二位,正成为女性健康安全的严重威胁。由于肿瘤异质性,乳腺癌可分为4种分子类型,分别为Luminal A、Luminal B、HER2过表达和三阴性乳腺癌（TNBC）,这是根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达状态决定的。在过去的十几年里,随着研究的不断深入,对乳腺癌患者的治疗水平和临床管理能力也在不断提高,但是乳腺癌患者的人数仍在逐年升高。就目前来看,乳腺癌主要依靠手术切除、内分泌治疗、分子靶向治疗和化学药物疗法,大多数早期、非转移性乳腺癌患者可以得到有效的治疗,但是晚期患者的治疗效果并不理想,这类患者通常伴有远处器官转移。值得注意的是,即使病理表现相似的患者,其预后可能截然不同。因此,寻找和探索更可靠、更有价值的预后标志物,提高乳腺癌患者的早期诊断和治疗水平,成为当前研究工作的重点。目的:1.初步探索TMEM196在乳腺癌中的功能和机制并构建TMEM196相关基因的预后列线图2.初步分析NR3C2在乳腺癌中的预后和免疫作用方法:1.通过癌症基因组图谱（TCGA）和Oncomine数据库分析TMEM196在乳腺癌中的表达,利用Kaplan-Meier数据库分析TMEM196在乳腺癌中的预后,通过免疫组化（IHC）对其蛋白水平进行验证;通过体外细胞功能实验探索TMEM196在乳腺癌中的作用;采用蛋白免疫印迹（WB）检测下游信号通路中关键基因的变化。2.分别以TCGA和GSE20685作为训练队列和测试队列,首先筛选TCGA队列中TMEM196的相关基因（P＜0.01）,通过LASSO回归建立预后模型,采用生存曲线和受试者工作特性曲线（ROC）对模型进行评价并在GSE20685队列中进行验证;然后,将上述队列合并,结合临床病理信息构建列线图,以校准曲线和时间相关一致性指数（C-index）对其进行评价。3.通过TCGA、GSE42568和Oncomine数据库分析NR3C2在乳腺癌中的转录水平;以无复发生存率（RFS）为结局指标,利用Kaplan-Meier数据库分析NR3C2对乳腺癌预后的影响;通过荧光定量PCR（RT-q PCR）和WB实验验证其表达。4.通过STRING数据库构建NR3C2的蛋白质互作（PPI）网络并在DAVID数据库中进行GO和KEGG富集分析;利用单样本基因集富集分析（ss GSEA）的方法定量TCGA样本中24种免疫细胞的浸润程度并分析NR3C2和免疫细胞以及免疫调节剂的相关性;采用基因集富集分析（GSEA）探讨NR3C2参与的潜在信号通路。结果:1.TMEM196通过降低β-catenin和MMP7的表达抑制乳腺癌的侵袭迁移（1）TMEM196的转录水平在乳腺癌中显著降低（P＜0.05）,在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中降低最明显（P＜0.05）;免疫组化（IHC）结果发现TMEM196的蛋白水平在乳腺癌中显著下降（P＜0.05）,在三阴性乳腺癌组织中最明显（P＜0.05）。（2）Kaplan-Meier数据库的结果提示TMEM196高表达和总体生存率（OS,HR=0.720,95%CI=0.523-0.992,P=0.045）以及无复发生存率（RFS,HR=0.643,95%CI=0.541-0.764,P＜0.001）均呈正相关;组织芯片（TMA）队列的生存分析提示高表达的TMEM196和较好的OS有关（HR=0.524,95%CI=0.293-0.936,P=0.040）;多因素Cox回归发现TMEM196可以作为乳腺癌独立的预后因素（HR=0.526,95%CI=0.277-0.998,P=0.049）。（3）体外细胞功能实验发现过表达TMEM196之后能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;敲低TMEM196的表达之后,能够显著增强乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。（4）过表达TMEM196之后能够抑制β-catenin和MMP7的表达,而干扰TMEM196之后能够升高β-catenin和MMP7的表达;在干扰细胞株中加入β-catenin抑制剂后能够消除由于敲低TMEM196所导致的促肿瘤作用,显著抑制乳腺癌细胞的迁移与侵袭并且降低MMP7的表达。2.结合多指标的列线图构建（1）经过筛选共得到1657个TMEM196相关基因（P＜0.01）,富集分析提示这些基因主要作用于信号转导、细胞黏附、凋亡过程、Hippo信号通路和自噬等;单因素Cox回归发现40个基因和OS显著相关（P＜0.01）,通过LASSO回归得到28个基因的预后模型。（2）根据公式计算风险值并对训练队列进行生存分析发现,高风险组患者的OS明显差于低风险组（HR=5.453,95%CI=3.825-7.774,P＜0.001）,ROC曲线提示2年、3年、5年的曲线下面积（Area under curve,AUC）分别为0.848、0.855和0.823。该模型在测试队列得到了验证（HR=1.748,95%CI=1.137-2.688,P=0.012）,其2年、3年和5年的AUC分别为0.669、0.686和0.649。结合临床参数的多因素Cox回归显示该模型在训练队列（HR=3.679,95%CI=2.955-4.579,P＜0.001）和测试队列（HR=1.531,95%CI=1.183-1.982,P=0.001）中均为独立的预后因子。该模型在不同的亚组中（Age、T、N、M、Stage）均能够较好的区分高/低风险的患者。（3）在合并队列中,生存曲线提示高风险组患者和较差的OS有关（HR=3.240,95%CI=2.468-4.255,P＜0.001）,ROC曲线显示其2年、3年、5年的AUC分别为0.779、0.796、0.753。Cox回归发现年龄（Age,HR=1.020,95%CI=1.009-1.031,P＜0.001）、病理分期（Stage,HR=1.020,95%CI=1.009-1.031,P＜0.001）和风险值（Risk,HR=1.020,95%CI=1.009-1.031,P＜0.001）可以作为乳腺癌独立的预后因子。基于上述3个指标构建列线图,校准曲线提示该列线图具有较好的准确性,C指数提示其具有较高的区分度,优于其他的单一指标。3.NR3C2在乳腺癌中表达降低并且和预后显著相关TCGA、GSE42568和Oncomine分析结果提示NR3C2的转录水平在乳腺癌中显著降低（P＜0.001）;在TCGA（HR=0.662,P=0.037）、Kaplan-Meier（HR=0.709,P＜0.001）、GSE20685（HR=0.614,P=0.030）和GSE21653（HR=0.456,P=0.001）队列中,生存分析发现高表达的NR3C2均和较好的RFS有关;RT-q PCR和WB结果显示NR3C2的表达在乳腺癌组织中显著降低。4.NR3C2参与多条肿瘤和免疫相关信号通路通过STRING数据库构建的PPI网络包含11个节点和41条边;KEGG富集分析提示,NR3C2参与雌激素信号通路、抗原处理和呈递、IL-17信号通路、Th17细胞分化和NOD样受体信号通路等;ss GSEA分析发现NR3C2和19种免疫细胞以及43种免疫调节剂显著关联（P＜0.05）;CIBERSORT分析显示,高表达的NR3C2和幼稚B细胞（P＜0.001）、CD8+T细胞（P=0.011）、静息状态的CD4+记忆T细胞（P＜0.001）和静息状态的肥大细胞（P＜0.001）呈正相关,而和巨噬细胞M0（P＜0.001）、巨噬细胞M2（P=0.021）呈负相关;GSEA结果提示,NR3C2和多种免疫信号通路有关,包括JAK-STAT信号通路（NES=2.22,P＜0.001）、TGF-β信号通路（NES=2.10,P＜0.001）、T细胞受体信号通路（NES=1.85,P＜0.001）和B细胞受体信号通路（NES=1.75,P＜0.001）等。结论:1.TMEM196通过调节β-catenin/MMP7信号通路抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,基于TMEM196相关基因构建的列线图能够有效的预测乳腺癌患者的预后,具有潜在的临床应用价值。2.NR3C2在乳腺癌中表达下调并且和多种免疫信号通路有关,有望成为乳腺癌患者的预后标志物。