【摘 要】
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麦角固醇是真菌细胞膜的组成成分,是多种重要类固醇药物的合成前体,极具经济价值。本研究筛选到一株工业酿酒酵母菌株S1,其初始胞内麦角固醇含量为7.8mg/g DCW。以其为出发菌,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,通过对麦角固醇合成代谢途径和胞内储存相关途径的改造,进一步提高麦角固醇产量。首先,过表达tHMG1（HMG-CoA还原酶1的催化区段）使胞内麦角固醇生物合成的前体鲨烯含量显著增加,
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麦角固醇是真菌细胞膜的组成成分,是多种重要类固醇药物的合成前体,极具经济价值。本研究筛选到一株工业酿酒酵母菌株S1,其初始胞内麦角固醇含量为7.8mg/g DCW。以其为出发菌,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,通过对麦角固醇合成代谢途径和胞内储存相关途径的改造,进一步提高麦角固醇产量。首先,过表达tHMG1（HMG-CoA还原酶1的催化区段）使胞内麦角固醇生物合成的前体鲨烯含量显著增加,但是麦角固醇含量没有明显变化。分别在出发菌株和鲨烯积累菌株中过表达固醇酰基转移酶ARE2以促进麦角固醇的酯化,获得菌株S1-ARE2和S1-tHA,两者麦角固醇胞含量水平相当,相比亲本菌株提高了 28%。鲨烯积累菌株中ARE2的过表达使鲨烯含量有所下降,说明强化麦角固醇的酯化有利于提高鲨烯到麦角固醇的代谢通量。在能同时积累鲨烯和麦角固醇的菌株S1-tHA中,尝试过表达后鲨烯途径关键酶ERG1（鲨烯环氧酶）和ERG11（羊毛固醇-14 α-脱甲基酶）来促进鲨烯到麦角固醇的合成,遗憾的是,实验数据表明这一策略并不能促进鲨烯向麦角固醇的转化。单纯通过提高麦角固醇合成途径中某几个酶的表达水平,对提高终产物麦角固醇胞含量的作用有限。此外,在菌株S1-ARE2中过表达组成型激活因子（UPC2-1）,可以使麦角固醇含量进一步增加到16.7mg/g DCW。考虑到疏水性固醇酯积累于脂质滴中,进一步增强脂肪酸的生物合成途径,以扩大麦角固醇的储存容量。过表达ACC1（乙酰辅酶A羧化酶）使麦角固醇含量增加到20.7 mg/g DCW。为了解决由于麦角固醇的过早积累而导致的生长抑制,采用了诱导型GAL1启动子来动态控制ARE2,UPC2-1和ACC1的过表达。由于生长状况的改善,麦角固醇胞含量增加到40.6mg/g DCW,比对照菌高出4.6倍,产量可以达到421.1 mg/L,比对照菌高出4.2倍。最后,进行两阶段分批补料发酵,麦角固醇产量达到2986.7 mg/L,胞含量为29.5mg/g DCW。本研究为麦角固醇及相关萜类物质的合成提供了 一种有效的代谢工程改造策略。
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