研究背景与目的结直肠癌是消化道肿瘤最常见的类型之一,也是世界上第三常见的癌症死亡原因,其转移严重威胁人类的生命质量。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）在肿瘤转移的发生过程中发挥着关键的作用。巨噬细胞属于常见的免疫细胞之一,理论上能够阻止肿瘤的发生发展。然而,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage,TAMs）丰度的增加通常与较差的预后相关。目前已有相当的研究报道,circRNA在外泌体的含量非常丰富并且十分稳定。细胞有可能通过将circRNA分泌到外泌体中进行输送。因为外泌体可以被多种细胞接收,其中还包括巨噬细胞,因此目前认为外泌体可以作为细胞间通讯的信使。然而,关于肿瘤细胞来源外泌体circRNA是如何调控巨噬细胞M2型极化进而影响结直肠癌进展,尚需更深入的探索。本研究为此探讨了结直肠癌细胞来源外泌体circRNA对结直肠癌微环境中的巨噬细胞M2极化状态的影响,并探讨了外泌体circRNA对巨噬细胞M2极化影响的具体机制以及其通过肿瘤微环境的改变从而影响结直肠癌转移的作用。为结直肠癌外泌体circRNA作为肿瘤细胞早期诊断标记物以及未来治疗靶点提供了研究基础和数据支持。研究方法:1.通过对6对结直肠癌组织及对应的癌旁组织行高通量测序,筛选出本研究目标circRNA,设计circ4234的反向引物及正向引物,通过进行核酸胶电泳以验证circ4234的环状结构;利用放线菌素D实验,通过qRT-PCR验证circ4234的环状结构。2.提取多种结直肠癌细胞系（HCT116和SW620,SW480,CACO2,LOVO）与一种正常的结直肠细胞系（FHC）的培养上清的外泌体,利用western blot及粒径分析鉴定所提取的外泌体,采用qRT-PCR技术检测结直肠肿瘤细胞系和正常细胞系外泌体中circ4234的表达情况。3.通过培养THP-1细胞,利用佛波酯（PMA）将其诱导成M0巨噬细胞,经过结直肠癌细胞外泌体HCT116、SW620进行诱导,建立M2型巨噬细胞模型,通过qRT-PCR及western blot实验检测其标志物的表达水平以证实M2型巨噬细胞模型的成功构建。4.在结直肠肿瘤细胞系HCT116和SW620的培养上清中提取外泌体,与经佛波酯（PMA）诱导的THP-1细胞进行共培养,在不同时间点（0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h）提取巨噬细胞的RNA,采用qRT-PCR技术检测经不同时间诱导的巨噬细胞内circ4234表达的变化。利用外泌体分泌抑制剂GW4869清除肿瘤培育上清中的外泌体,利用已被清除外泌体的肿瘤上清培养巨噬细胞,通过qRT-PCR的方式检测巨噬细胞内circ4234的表达情况。5.结直肠细胞系HCT116与SW620中敲低circ4234后,提取肿瘤细胞上清外泌体,与经PMA诱导的THP-1细胞共孵育24-48h,通过qRT-PCR,western blot等方式检测巨噬细胞M2标志物CD206,IL10,CD301的表达情况。6.构建细胞体外共培养模型,采用Transwell实验检测空白组,共培养对照组和共培养敲低组细胞迁移和侵袭能力的变化。明确外泌体circ4234通过影响巨噬细胞极化从而影响结直肠癌的迁移和侵袭能力。采用western blot实验检测空白组,共培养对照组和共培养敲低组细胞EMT相关分子ZEB1的表达情况。7.通过生物信息学,双荧光素酶报告实验,qRT-PCR验证circ4234的靶基因以及miR-379-3p的靶基因。Western blot检测STAT3信号通路关键分子p-STAT3的蛋白表达水平。研究结果:1.根据高通量测序结果并与免疫相关基因行相关性分析,筛选出顶级候选circRNA-circ4234;核酸电泳结果显示:circ4234的反向引物于cDNA的产物中可见明显条带,而正向引物于cDNA及gDNA的产物中均可见明显条带。放线菌素D结果显示,circ4234的衰减速度明显慢于其亲本基因POLQ的衰减速度,进而证明circ4234的环状结构。2.通过Western blot方法鉴定结直肠癌细胞外泌体,发现外泌体特异性蛋白CD9及TSG101呈现出明显的高表达,粒径分析结果显示:所提取外泌体直径处于30-150nm之间,qRT-PCR结果显示:结直肠癌细胞系（HCT116、SW620、SW480、LOVO、CACO2）外泌体与结直肠正常粘膜细胞系（FHC）外泌体相比,circ4234的表达显著升高（p＜0.01）3.qRT-PCR结果显示:随着时间的推移,巨噬细胞内circ4234的表达情况不断升高。经外泌体分泌抑制剂GW4869处理的上清孵育的巨噬细胞内circ4234的表达量与对照组相比明显下降（P＜0.01）。4.qRT-PCR结果显示:经过敲低circ4234的肿瘤细胞外泌体孵育的巨噬细胞与对照组外泌体孵育的巨噬细胞相比,M2极化标志物CD206,IL10,CD301的表达显著下降（P＜0.01）,而经过过表达circ4234的肿瘤细胞外泌体孵育的巨噬细胞与对照组外泌体孵育的巨噬细胞相比,M2极化标志物CD206,IL10,CD301的表达显著升高（P＜0.01）,western blot结果显示:经过敲低circ4234的肿瘤细胞外泌体孵育的巨噬细胞与对照组外泌体孵育的巨噬细胞相比,M2极化标志物CD206,IL10,CD301的表达显著下降（P＜0.01）,而经过过表达circ4234的肿瘤细胞外泌体孵育的巨噬细胞与对照组外泌体孵育的巨噬细胞相比,M2极化标志物CD206,IL10,CD301的表达显著升高（P＜0.01）。5.Transwell实验结果显示:共培养对照组相比于空白组迁移和侵袭能力明显增强（P＜0.05）;共培养处理组相比于共培养对照组,结直肠癌细胞的转移能力明显降低（P＜0.05）;Western blot结果显示:共培养对照组相比于空白组,EMT相关分子ZEB1的蛋白表达明显升高;而共培养敲低组相比于共培养对照组,EMT相关分子ZEB1的蛋白表达明显下降。6.双荧光素酶报告实验结果显示:在过表达miR-379-3p组中,circ4234野生型组的荧光发生明显下降（P＜0.01）,突变组并没有明显变化。IL10野生型组的荧光发生明显下降（P＜0.01）,突变组并没有明显变化;qRT-PCR结果显示:将敲低circ4234结直肠癌细胞系HCT116和SW620培养上清中提取的外泌体和巨噬细胞共培养后,与对照组相比,敲低circ4234的外泌体培养组的miR-379-3p的表达量明显升高（P＜0.01）;miR-379-3p inhibitor会逆转si-circ4234对巨噬细胞M2极化标志物CD206,IL10,CD301的影响（P＜0.01）。Western blot结果显示:miR-379-3p inhibitor会逆转巨噬细胞M2极化标志物CD206,IL10,CD301的表达（P＜0.01）;qRT-PCR结果显示:向巨噬细胞中转染miR-379-3p-mimic后,相对于对照组,IL10以及巨噬细胞M2极化相关分子CD206,IL10,CD301的表达发生明显下降（P＜0.01）;向巨噬细胞中转染miR-379-3p-inhibior后,相对于对照组,IL10以及巨噬细胞M2极化相关分子CD206,IL10,CD301的表达发生明显上升（P＜0.01）;qRT-PCR结果显示:相对于miR-379-3p-mimic组,miR-379-3p-mimic与1v-IL10共转组中IL10以及巨噬细胞M2极化相关分子CD206,IL10,CD301的表达发生了明显逆转（P＜0.01）,STAT3通路关键分子p-STAT3的表达同样发生明显逆转。研究结论:1.外泌体circ4234在结直肠癌细胞及外泌体中特异性高表达。2.外泌体circ4234可以被巨噬细胞摄取,促进巨噬细胞M2型极化。3.外泌体circ4234进入巨噬细胞后可以靶向miR-379-3p,从而影响巨噬细胞的M2极化水平,并进一步促进结直肠癌细胞的转移。4.外泌体circ4234靶向miR-379-3p进一步影响IL10/STAT3信号通路,从而影响了巨噬细胞M2极化水平,促进了结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。