【摘 要】
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目的:血脑屏障（blood-brainbarrier,BBB）的破坏是缺血性脑卒中的主要病理特征之一。连接蛋白的减少和结构变化导致BBB的破坏和血管通透性的增加,这使有害物质流入大脑并加重脑损伤。研究表明磷酸二酯酶4（phosphodiesterase4,PDE4）在缺血性脑卒中发生后表达升高;抑制PDE4酶活性对缺血性脑卒中具有保护作用,然而其机制有待进一步研究。本课题拟在人脑微血管内皮细胞（H
【基金项目】
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广州市科技计划基础与应用基础研究项目（No.202002030494）；
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目的:血脑屏障（blood-brainbarrier,BBB）的破坏是缺血性脑卒中的主要病理特征之一。连接蛋白的减少和结构变化导致BBB的破坏和血管通透性的增加,这使有害物质流入大脑并加重脑损伤。研究表明磷酸二酯酶4（phosphodiesterase4,PDE4）在缺血性脑卒中发生后表达升高;抑制PDE4酶活性对缺血性脑卒中具有保护作用,然而其机制有待进一步研究。本课题拟在人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cells,HBMEC）和 SD（Sprague-Dawley）大鼠构建缺血性脑卒中体内、体外模型,考察PDE4抑制剂罗氟司特（Roflumilast,Roflu）能否减轻缺血性脑卒中引起的BBB损伤及可能的作用机制。方法:（1）在HBMEC细胞中构建氧糖剥夺模型（Oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation,OGD/R）,确定体外BBB损伤模型的造模条件;采用Lipofectamine 2000 转染 PDE4B 质粒、PDE4B siRNA 和 Hesl siRNA 转染细胞;采用Western blot检测连接蛋白（Occludin、VE-Cadherin、ZO-1）、凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、Bax、Bcl-xl、Bcl-2）、Notch 信号通路相关蛋白（Notch1、Hes1）的表达;采用MTT法、钙黄绿素和碘化丙啶染色检测凋亡细胞死亡率;（2）在大鼠中建立大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型;采用神经功能缺失评分评价MCAO大鼠的运动功能得分;采用伊文斯蓝（Evans blue）染色检测MCAO大鼠BBB的完整性;采用Western blot检测MCAO大鼠皮层缺血半暗带区连接蛋白和Notch信号通路相关蛋白的表达水平;采用免疫荧光观察大鼠脑组织缺血半暗带区血管和形态以及其中紧密连接蛋白的表达情况。结果:（1）OGD/R处理细胞,细胞内连接蛋白的表达呈时间依赖性地降低;（2）过表达PDE4B显著降低细胞内连接蛋白的水平,而敲减PDE4B则显著增加细胞内连接蛋白和抗凋亡相关蛋白的表达水平;（3）Roflu能够减少连接蛋白的丢失,降低细胞凋亡;（4）H89能够阻断Roflu对抗细胞凋亡的作用,阻断抑制连接蛋白减少的作用,并且能阻断Roflu对Notch信号通路的激活;（5）γ-分泌酶抑制剂DAPT和si-Hesl都能够阻断Roflu抑制连接蛋白减少和降低细胞凋亡的作用;（6）Roflu能够降低MCAO大鼠的神经功能缺失评分,减小BBB通透性,减少皮层缺血半暗带区连接蛋白蛋白的丢失,增强Occcludin、ZO-1的荧光强度,维持MCAO大鼠脑部微血管形态的完整性。结论:（1）PDE4抑制剂Roflu能减轻OGD/R诱导的HBMEC细胞BBB损伤。其机制可能是Roflu激活了 PKA/Notchl/Hes1,减少内皮细胞的凋亡,并增加连接蛋白的表达。（2）Roflu能改善MCAO大鼠神经功能缺失症状,减小BBB通透性,减少连接蛋白的丢失,从而维持脑部微血管形态的完整。其机制可能与Roflu激活Notch信号通路有关。
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