第一部分预测SCN1A基因变异相关癫痫严重表型的危险因素分析目的:总结SCN1A基因变异相关癫痫患儿的临床及遗传特点,分析导致严重表型的危险因素,并评估其预测价值。方法:收集2015年1月至2022年1月在重庆医科大学附属儿童医院诊治的111名SCN1A基因变异相关癫痫患儿的临床资料,通过门诊复诊及电话随访患儿的病情发展、治疗及预后情况。通过单因素分析及多因素logistic回归分析影响严重癫痫表型的主要危险因素。计算危险因素与预后的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）,通过诊断试验评价指标比较各种危险因素的预测价值。结果:（1）111例患儿中,男51例,女60例,首次癫痫发作的中位年龄为6月龄（2月～3岁）,1岁及以内起病98例（88.3%）。严重表型65例（58.6%）,主要包括Dravet综合征47例（42.3%）,SCN1A基因相关发育性癫痫性脑病16例（14.4%）,SCN1A基因相关难治性癫痫2例（1.8%）;中间型癫痫17例（15.3%）;轻微表型29例（26.1%）,包括遗传性癫痫伴热性惊厥加症14例（12.6%）,热性惊厥附加症10例（9.0%）,热性惊厥5例（4.5%）。（2）本组患儿中,至少有6种癫痫发作类型,其中有偏侧性或局灶运动性发作者70例（63.1%）,肌阵挛发作38例（38.8%）,失神或不典型失神发作35例（31.5%）,失张力发作8例（7.2%）。病程中有癫痫持续状态者76例（69.1%）。（3）基因检测发现SCN1A基因变异类型包括:错义变异63例（56.8%）,其中30例（46.9%）位于核心区（S4-S6）,26例（40.6%）位于非核心区;无义变异19例（17.1%）,移码变异13例（11.7%）,剪切位点变异10例（9.0%）,微缺失/重复3例（2.7%）,大片段缺失2例（1.8%）,内含子变异1例（0.9%）。（4）111例患儿中,除3例（2.7%）未使用抗癫痫发作药物（Antiseizure medications,ASMs）治疗外,其余108例患儿经过1-8种ASMs治疗,其中单药治疗18例（16.2%）,经三种及以上ASMs者72例（64.8%）;16例（14.4%）使用过生酮饮食治疗。治疗后,发作完全控制11例（10.2%）,显效31例（28.7%）,好转30例（27.8%）,无效36例（33.3%）;其中37例（33.3%）使用过钠通道阻滞剂,控制无效或发作加重36例。（5）多因素logistic回归分析结果发现癫痫持续状态（OR=5.155）和严重变异类型（OR=5.042）是导致严重表型的危险因素;ROC分析结果提示,当患儿首次发作年龄小于7.5月、呈现癫痫持续状态、SCN1A基因显示位于核心区的错义变异、无义变异、移码变异、剪切位点变异及缺失/重复等严重变异时,诊断患儿呈严重癫痫表型的敏感度为75.6%,特异度为87.1%,ROC曲线下面积为0.833。（6）SCN1A基因位于钠通道核心区之内的错义变异,74.1%表现为较严重的癫痫表型;而位于核心区之外的错义变异,83.3%表现为非严重的癫痫表型,差异有统计学意义（P＜0.001）。但错义变异位置与临床表型的联系并不完全对应。结论:SCN1A基因变异相关癫痫的临床表型具有高度异质性,特征性临床表现有助于早期识别该基因变异的癫痫患儿。当患儿首次癫痫发作年龄早于7.5月、出现癫痫持续状态、基因变异类型严重时,需高度警惕SCN1A基因变异相关严重癫痫表型的可能。第二部分SCN1A基因非核心区错义变异致严重癫痫表型的机制研究目的:确认位于核心区之外SCN1A基因错义变异与严重的癫痫表型的关系,探讨所筛选出的SCN1A基因非核心区错义变异（p.W1271R）导致严重癫痫表型的发病机制。方法:（1）收集111例SCN1A基因变异相关癫痫患儿中,变异位于核心区外的患儿的临床资料,分析临床表型,筛选出与严重表型相关的核心区外基因变异位点。（2）通过T-coffee在线软件对变异位点的物种保守性进行对比分析。通过UCSF Chimera 1.15软件,模拟SCN1A基因变异前后蛋白质三维结构的变化,预测基因变异对钠通道Nav1.1的结构及功能产生的影响。（3）构建SCN1A基因野生型及携带有该基因变异的质粒,分别转染至HEK293T细胞。通过膜片钳实验,研究该变异对Nav1.1电流密度、电压依赖性激活、电压依赖性稳态失活、失活后恢复等电生理参数的影响。（4）提取Nav1.1总蛋白和膜蛋白,通过Western blot实验检测变异对Nav1.1表达的影响。结果:（1）在本组患儿中,4例患儿呈现癫痫严重表型,而SCN1A基因变异位于核心区外。筛选出其中1例考虑为Dravet综合征的患儿,该患儿起病早,临床发作具有热敏感性,1岁后出现肌阵挛发作,并伴有认知、语言发育落后及步态异常,脑电图出现全脑广泛的尖-慢波,先后经5种ASMs治疗后,癫痫发作为控制。（2）该例患儿SCN1A基因呈非核心区错义变异（p.W1271R）,经物种间保守性分析显示该变异位点呈高度保守性,蛋白质三维分析结果提示该变异导致非极性的色氨酸变成极性的精氨酸,根据Grantham公式计算氨基酸变化D值为101,氨基酸的理化性质发生了改变。（3）膜片钳结果提示,W1271R变异型导致转染HEK293T细胞Nav1.1峰值电流密度明显降低（P＜0.001）;激活曲线往去极化方向偏移,Nav1.1 W1271R变异型的半数激活电位明显低于野生型（P＜0.001）,斜率因子显著大于野生型（P＜0.001）;失活曲线往超极化方向偏移,Nav1.1 W1271R变异型的半数失活电位明显高于野生型（P＜0.001）,斜率因子显著大于野生型（P＜0.001）。Nav1.1 W1271R变异型的失活后恢复的快时间常数和慢时间常数均大于野生型（P=0.024和P＜0.001）。（4）Western blot检测发现与野生型相比,W1271R变异型的Nav1.1总蛋白表达稍有降低,但无统计学意义（P=0.112）,但膜蛋白表达明显降低（P＜0.001）。结论:SCN1A基因非核心区W1271R变异导致Nav1.1整体电流的降低、钠通道的敏感性及可用性降低、复活时间延长;Nav1.1膜蛋白表达降低。由此推测SCN1A基因非核心区错义变异（W1271R变异）出现严重表型的原因可能与其影响Nav1.1的转运和降解,导致细胞膜上Nav1.1的表达减少;同时影响钠通道的电生理特性,最终导致Nav1.1通道的功能丧失有关。第三部分Nav1.1功能损害致严重癫痫表型的靶向治疗探索目的:探讨泛素化在调控Nav1.1翻译后修饰中所起的作用,以及通过该靶点进行精准治疗的可能性,并研究芬氟拉明改善SCN1A基因变异导致Nav1.1损害的可能机制。方法:使用蛋白酶体抑制剂MG-132、芬氟拉明干预转染Nav1.1W1271R错义变异质粒的HEK293T细胞,通过膜片钳及Western blot实验,检测上述两种药物干预对Nav1.1功能及表达的改变情况。构建Nedd4-2真核细胞表达质粒,与野生型SCN1A基因质粒共转染至HEK293T细胞,通过膜片钳及Western blot实验,分析过表达Nedd4-2对Nav1.1功能及表达的改变情况,并采用免疫共沉淀技术分析Nav1.1与Nedd4-2之间是否存在相互作用,从而探讨两者间的相互联系。提取表达野生型和变异型Nav1.1及芬氟拉明、MG-132干预后的HEK293T细胞的总蛋白,通过Western blot检测Nedd4-2的表达情况。结果:（1）膜片钳结果提示,8μM MG-132干预可提高约30%的Nav1.1 W1271R的钠电流,但6μM、8μM及10μM三种浓度的MG-132干预均未显著提高Nav1.1的峰值电流密度（P=0.389;P=0.124;P=0.124）,干预后的半数激活电位（P=0.594;P=0.061;P=0.733）及斜率因子（P=0.542;P=0.624;P=0.665）与DMSO对照组比较也无显著性差异;而Western blot结果提示,8μM的MG-132干预后,Nav1.1W1271R总蛋白表达无明显改变（P=0.690）,但膜蛋白表达有升高（P=0.020）。（2）膜片钳结果提示,过表达Nedd4-2导致Nav1.1峰值电流密度明显降低（P=0.008）,不影响半数激活电位（P=0.108）,但斜率因子高于转染空载质粒组（P=0.046）;过表达Nedd4-2不影响半数失活电位（P=0.159）及斜率因子（P=0.666）;而Western blot结果提示,过表达Nedd4-2未影响Nav1.1总蛋白的表达（P=0.401）,但膜蛋白的表达情况明显降低（P=0.041）。（3）免疫共沉淀实验发现Nav1.1抗体可以拉下Nedd4-2蛋白,两者之间存在相互作用。（4）膜片钳结果提示,20μM及30μM两种浓度的芬氟拉明干预均明显提高Nav1.1的峰值电流密度（P=0.047;P=0.023）,但干预后的半数激活电位（P=0.529;P=0.640）及斜率因子（P=0.650;P=0.261）与DMSO对照组比较无显著性差异;而Western blot结果提示,25μM的芬氟拉明干预后,Nav1.1 W1271R总蛋白表达无明显改变（P=0.600）,但膜蛋白表达有升高（P=0.034）。（5）Western blot结果提示,Nedd4-2在表达野生型和变异型Nav1.1及芬氟拉明、MG-132干预后的HEK293T细胞中无明显差异（P=0.111;P=0.874;P=0.937）。结论:泛素化修饰参与了Nav1.1的转运和降解,其可能是新药研发或者老药新用的潜在作用靶点,对该靶点的干预有助于实现SCN1A基因变异患者的精准治疗;而芬氟拉明可能通过增加Nav1.1膜蛋白的表达,并提高钠电流来减轻SCN1A基因相关Dravet综合征的癫痫发作。