高盐腌制蔬菜亚硝酸盐微生物自行降解机制研究

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腌制蔬菜亚硝酸盐危害问题一直以来为人们所重视。根据腌制过程中盐添加量的多少可以将腌制蔬菜分为低盐腌制蔬菜和高盐腌制蔬菜,它们在腌制过程中都普遍存在亚硝酸盐先升高后下降的过程,这主要是由于微生物的作用。目前针对低盐腌制蔬菜的有关研究结果表明,这类腌制蔬菜的亚硝酸盐降解过程主要包括乳酸菌的前期酶降解和后期酸降解两个阶段。但截至目前,仍未见有关高盐腌制蔬菜亚硝酸盐微生物降解机制的报道。此外,虽然高盐腌制蔬菜腌制完成时的亚硝酸盐含量大多已符合国标(20 mg/kg),但其残存硝酸盐含量却依旧很高,这些硝酸盐被人体食入后容易被肠道内一些微生物还原为亚硝酸盐,从而造成亚硝酸盐二次危害,该问题也同样值得重视和研究。为解决高盐腌制蔬菜亚硝酸盐危害,本文以盐渍萝卜作为高盐腌制蔬菜的代表,对其进行亚硝酸盐微生物降解机制方面的研究,主要研究内容及结果如下:(1)高盐腌制蔬菜亚硝酸盐微生物降解途径的确定。首先,确定了高盐环境下亚硝酸盐发生酸降解的p H临界值为4.5——腌制体系p H≤4.5时,亚硝酸盐即发生酸降解。然后对盐渍萝卜腌制过程中p H、硝酸盐、亚硝酸盐及铵根含量的测定结果表明,整个腌制过程中p H>4.5,说明高盐腌制蔬菜不存在亚硝酸盐酸降解途径;腌制第7天时,出现“亚硝峰”——峰值为34.44 mg/kg,超过国标,存在亚硝酸盐安全隐患;腌制末期硝酸盐残存量高达172.15 mg/kg,存在亚硝酸盐二次危害;铵根含量极低且始终未有明显变化,由此明确了高盐腌制蔬菜亚硝酸盐微生物降解途径为反硝化酶降解。(2)高盐腌制蔬菜亚硝酸盐降解微生物类群解析。采用高通量测序技术对不同腌制时期的微生物群落结构进行解析,结果表明,腌制初期优势微生物为细菌,主要包括占比41.05%的芽孢杆菌属(Bacillus)和占比17.35%的假单胞菌属(Pseudomonas),另有还有占比仅为19.13%的嗜盐古菌(Halophilic Archaea);腌制中期,芽孢杆菌和假单胞菌相对丰度分别下降至7.74%和0.07%,而嗜盐古菌相对丰度却上升至48.38%;腌制末期,嗜盐古菌已占据绝对优势,丰度高达49.01%,其中优势属为盐棒杆菌属(Haloarcula,17.01%),其次为盐薄片菌属(Halolamina,8.60%),Halovenus属(6.85%)以及盐简菌属(Halosimplex,5.52%)。由此推测在高盐腌制蔬菜中发挥亚硝酸盐酶降解作用的微生物类群可能为嗜盐古菌。(3)嗜盐古菌的分离筛选及关键功能菌株全基因组解析。随后,采用培养法对这些嗜盐古菌进行分离筛选,共分离得到了分属于Haloarcula、Halorubrum、Halobacterium、Halovenus、Halolamina、Halosimplex、Halostella以及Haloarchaeobius等8个属的16株嗜盐古菌。从中选取硝酸盐、亚硝酸盐降解效果优异的两株关键功能菌株——Halostella sp.R3-12和Haloarchaeobius sp.R2-4,进行全基因组测序以及硝酸盐、亚硝酸盐代谢通路预测,以解析它们的内在降解代谢机制。结果表明,菌株R2-4是一株可以彻底降解亚硝酸盐的短程反硝化菌株,可作为解决高盐腌制蔬菜中亚硝酸盐危害的理想菌株;菌株R3-12是一株可以彻底降解硝酸盐的全程反硝化菌株,可作为解决高盐腌制蔬菜腌制完成后残存硝酸盐危害的理想菌株。(4)关键功能菌株降解条件优化及直投模拟应用。最后,采用响应面法对菌株R2-4和菌株R3-12进行降解条件的优化,同时辅以模拟直投实验来对它们进行实际腌制过程中硝酸盐、亚硝酸盐降解能力的验证。响应面优化结果表明,两者最优硝酸盐、亚硝酸盐降解条件非常相近,C/N均在6~8左右,摇动速度均在50 r/min左右、p H均在6.6左右,盐浓度均在20%左右。模拟直投结果表明,添加菌株R2-4后,盐渍萝卜整个腌制过程的亚硝酸盐含量显著降低,且始终在国标以下,“亚硝峰”峰值仅为7.24 mg/kg;添加了菌株R3-12后,整个腌制过程的硝酸盐含量也显著降低,腌制末期仅为36.42 mg/kg。以上结果可为这些菌株将来在高盐腌制蔬菜乃至其他高盐食品中的实际应用提供重要参考。
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