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卵巢组织冷冻保存是保护女性癌症患者生育能力的重要方法,通过卵巢组织的冷冻、复苏和移植不仅能够保留年轻女性的生殖潜能,而且可以恢复卵巢的内分泌功能。玻璃化冷冻是一项利用快速降温将组织转变为玻璃化固体状态的技术,能够保留细胞内、外液分子和离子的正常分布。玻璃化冷冻技术以其快速、高效、低成本等优势,成为卵巢组织冷冻的重要技术手段。但遗憾的是,目前卵巢组织冷冻技术尚不完全成熟,也尚无公认、标准化且最佳的玻璃化溶液配方。多项研究表明,氧化应激反应是影响玻璃化冷冻效果的关键因素之一,氧化应激反应中产生的活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)能够导致卵巢细胞凋亡或功能障碍,使卵母细胞存活率下降,降低卵巢组织的发育能力。褪黑素(Melatonin,MLT)属于神经内分泌激素,具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤等多项生理功能,尤其作为一种有效的抗氧化剂,可以通过多种机制抵抗氧化应激反应。目前,已有文献报道褪黑素对精子的冷冻复苏具有保护作用,但国内外尚少见褪黑素在卵巢组织玻璃化冷冻技术中的应用研究报道。本研究发现,在玻璃化冷冻液和复苏液中加入褪黑素,可以改善KM小鼠卵泡细胞形态,保护卵巢组织结构完整性,可能与增加卵巢组织抗氧化能力、减少活性氧产生、抑制卵泡细胞凋亡有关。本实验可能为卵巢组织冷冻技术的优化研究提供新思路。目的:1.探讨褪黑素在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中对卵巢组织是否具有保护作用。2.寻找褪黑素保护卵巢组织结构完整性的可能最适浓度。3.探讨褪黑素在玻璃化冷冻复苏过程中对卵巢组织保护性作用的可能相关机制。方法:1.卵巢组织的收集及分组:取53只SPF级青春期雌性KM小鼠,行双侧卵巢切除术,随机分为新鲜对照组(n=6)和行玻璃化冷冻复苏的实验组(n=100)。实验组根据冷冻液和复苏液中褪黑素浓度的不同分为5个亚组,分别为0m M MLT组、0.001m M MLT组、0.01m M MLT组、0.1m M MLT组和1m M MLT组(n=20)。2.卵巢组织玻璃化冷冻复苏后HE染色镜检进行各实验组各级卵泡计数和直径测量。3.卵巢组织玻璃化冷冻复苏后TUNEL实验检测各实验组卵泡细胞凋亡率。4.采用RT-q PCR法检测各实验组抗氧化相关基因(Nrf2、HO-1、Hsp90 AA1)、凋亡相关基因(Bcl-2、Bax)的m RNA表达水平。5.采用蛋白印迹法检测各实验组抗氧化相关蛋白Hsp90、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)的表达水平。6.使用抗氧化试剂盒检测抗氧化物酶指标(GSH-Px、T-SOD、CAT)、抗氧化物指标GSH、总抗氧化能力指标T-AOC、脂质过氧化产物MDA以及LDH的活性。结果:1.褪黑素增加实验组各级卵泡形态正常率:在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡形态正常率高于未添加褪黑素组,且0.1m M MLT组原始卵泡(P<0.01)、初级卵泡(P<0.001)、次级卵泡(P<0.001)和窦状卵泡(P<0.05)形态正常率最高。2.褪黑素降低实验组各级卵泡直径:在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡直径均低于未添加褪黑素组,而且0.1m M MLT组原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡直径最低(P<0.001)。0.01m M、0.1m M、1m M MLT组窦状卵泡直径均低于未添加褪黑素的实验组,而且0.1m M和1m M MLT组窦状卵泡直径最低(P<0.001)。3.褪黑素降低实验组各级卵泡凋亡率:在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组卵泡凋亡率均低于未添加褪黑素组,而且0.1m M和1m M MLT组卵泡凋亡率最低(P<0.01)。4.褪黑素上调KM小鼠卵巢组织Nrf2、HO-1、Hsp90AA1和Bcl-2m RNA的表达水平在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,0.001m M、0.01m M、0.1m M MLT组Nrf2 m RNA的相对表达水平均高于未添加褪黑素组,其中0.1m M MLT组Nrf2 m RNA的相对表达水平最高(P<0.01),1m M MLT组与未添加褪黑素的组Nrf2 m RNA相对表达水平无差异(P=0.113)。添加褪黑素的实验组HO-1 m RNA的相对表达水平均高于未添加褪黑素组,其中0.1m M和1m M MLT组HO-1 m RNA的相对表达水平最高(P<0.05)。添加褪黑素的实验组Hsp90AA1和Bcl-2的m RNA相对表达水平均高于未添加褪黑素组,其中0.1m M MLT组Hsp90AA1和Bcl-2的m RNA相对表达水平最高(P<0.05)。5.褪黑素下调Bax m RNA的表达水平在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组Bax m RNA的相对表达水平均低于未添加褪黑素组,其中0.1m M MLT组Bax m RNA的相对表达水平最低(P<0.01)。6.褪黑素上调卵巢组织Hsp90和Bcl-2的蛋白表达水平在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组Hsp90和Bcl-2蛋白相对表达水平均高于未添加褪黑素组,且0.1m M MLT组Hsp90(P<0.01)和Bcl-2蛋白(P<0.05)相对表达水平最高,其中1m M MLT组Hsp90蛋白相对表达水平低于其他添加褪黑素的实验组(P<0.001)。7.褪黑素下调Bax的蛋白表达水平在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组Bax蛋白的相对表达水平均低于未添加褪黑素组,其中0.1m M MLT组Bax蛋白的相对表达水平最低(P<0.001)。8.褪黑素显著提高GSH-Px、GSH、T-SOD、CAT、T-AOC的活性在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组GSH-Px、GSH、CAT、T-AOC活性均高于未添加褪黑素组,其中0.1m M MLT组GSH-Px(P<0.01)、GSH(P<0.001)、CAT(P<0.01)、T-AOC(P<0.05)活性最高。添加褪黑素的实验组T-SOD活性均高于未添加褪黑素组,其中0.01m M、0.1m M和1m M MLT组T-SOD活性均较高(P<0.01)。9.褪黑素显著降低MDA活性在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组MDA活性均低于未添加褪黑素组,其中0.1m M和1m M MLT组MDA活性最低(P<0.01)。10.褪黑素对各实验组卵巢组织LDH活性水平无明显影响在KM小鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏过程中添加褪黑素后,各实验组卵巢组织中LDH活性水平无显著性差异(P=0.145)。结论:1.在KM小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻和复苏过程中,加入褪黑素能够改善卵泡细胞形态、保护卵巢组织结构完整性,可能的最适浓度为0.1m M,且此浓度毒副作用较小。2.褪黑素对卵巢组织的保护作用可能与增加卵巢组织抗氧化能力、减少活性氧产生、抑制卵泡细胞凋亡有关。