论文部分内容阅读
抗坏血酸(AsA)是植物抗氧化系统中起非常重要作用的一种物质,而且在植物体的其它多种生理反应中也是不可或缺的一种物质。在人体中,抗坏血酸在维持人体机能正常运转过程中起到了无法替代的作用,而人类又不具有自身合成抗坏血酸的功能,只能通过外界摄取所需的抗坏血酸。外界摄取的主要途径是食用新鲜的瓜果蔬菜,番茄是人类饮食中最常见的高抗坏血酸含量的蔬菜。因此研究如何提高番茄中抗坏血酸含量具有重要意义。现在在番茄中已经克隆到了多个抗坏血酸合成代谢主要途径相关基因,但对于机体是如何调控抗坏血酸的代谢还有待继续研究。本研究利用全基因组重测序数据和测序材料果实材料抗坏血酸含量关联分析,在6号和9号染色体得到了相关性显著的主效SNP,并在主效SNP上下50Kb的范围内候选了 6个基因。通过在表达水平的筛选最终筛选了两个基因进行了转基因功能验证。本课题的主要结果如下:1.通过关联分析在6号和9号染色体得到了几个候选区段,并在其中候选了 6个基因,基因注册号分别是Solyc06g009200,Solyc09g064680,Solyc09g064670,Solyc09g066290,Solyc09g065810,Solyc09g065820。2.用实时荧光定量PCR技术,对6个候选基因在抗坏血酸含量高低差异番茄材料中的相对表达量进行了测定,结果Solyc06g009200和Solyc09g064680的表达量和抗坏血酸含量呈线性关系。Solyc06g009200在高含量番茄材料中表达量低,在低含量番茄材料中表达量高;Solyc09g064680在差异番茄材料中的表达量与Solyc06g009200基因的结果相反。其它4个基因在差异番茄材料中的表达量是不规律的。3.根据基因结构分析,发现Solyc06g009200是一个多聚半乳糖醛酸酶(PGA4);Solyc09g064680 属于番茄 NBS-LRR 家族中 NL 亚族中的一员(NL32)。4.根据表达水平分析结果,构建了SlNL32基因的干涉载体和SlPGA4基因的超量表达载体,用农杆菌介导的遗传转化法转化野生型番茄材料Ts265,PCR检测筛选得到了阳性的转基因番茄植株。5.分析目的基因在转基因植株中的表达情况,SlNL32基因在干涉株系中的表达受到抑制;SlPGA4基因在超量表达植株中的表达量明显高于对照。6.参考Gillespie等报道的测定抗坏血酸的方法,用酶标仪测定转基因植株的叶片和果实中抗坏血酸的含量。结果干涉SlNL32基因株系的叶片和果实中抗坏血酸含量都显著地升高了;和对照比,超表达SlPGA4基因的转基因株系叶片和果实中抗坏血酸含量明显下降了。7.分析已知的番茄抗坏血酸合成代谢途径主要基因在转基因植株叶片和果实的表达情况。结果显示在SlNL32基因干涉株系的叶片中合成途径的大多数酶基因都呈现上调表达,氧化代谢途径的cAPX表达升高,AO、tAPX和AOBP的表达受到了显著地抑制;在红熟果实中D-Man/L-Gal合成途径基因上调表达,肌醇途径MIOX的表达量与对照相比明显降低。超量表达SlPGA4基因的植株叶片中除了 PMI、MDHAR和DHAR三个基因受到抑制外,其它合成基因的表达都有所升高,氧化代谢相关的除tAPX表达受抑制,另外3个基因的表达提高了;在果实中D-Man/L-Gal途径相关的基因GPI、PWI、GMP1、GMP2、GMP3和GPP1表达水平升高显著,肌醇途径的MIOX表达水平下降,还原再生途径的MDHAR表达受到上调影响,而DHAR受到抑制。氧化代谢相关基因cAPX和tAPX下调表达程度显著,AO和AOBP呈现出上调的现象。8.在1/2MS培养基上用百草枯和NaCl处理SlNL32干涉株系和对照Ts265的幼苗。结果经百草枯处理后,干涉系和对照长势都受到抑制,但是转基因系的相对主根长和株高显著高于对照。而NaCl处理后对照和转基因系没有差异。这一结果表明SlNL32干涉株系抗百草枯的能力增强,而耐盐性没有变化。