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研究背景:世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）于2021年发布的全球最新癌症数据显示,肺癌新增人数为220万,而乳腺癌达到226万,乳腺癌已正式取代肺癌,成为全球第一大癌症。目前对乳腺癌的靶向治疗已运用到临床中,但可精准确定的靶点较少,其发生机制不甚了解。因此,探索乳腺癌新的治疗靶点及其发生机制,具有重要的理论研究价值和临床实际意义。Micro RNA（miRNA）,通过与其对应的靶基因m RNA的3,-非翻译区相互结合,导致m RNA的降解或抑制m RNA的翻译,从而沉默靶基因的表达。不同的miRNA通过调控下游靶基因的表达发挥不同的功能,参与调节各种生理和病理过程,其中包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期进展、迁移和侵袭等。为确定乳腺癌与临床病理相关的miRNA,综合分析了肿瘤基因组图谱（TCGA）中的miRNA表达、整体基因表达和患者生存情况,发现12种成熟的miRNA表达异常。MiR-200c作为乳腺癌中表达水平异常的miRNA之一,探索miR-200c及其靶点在乳腺癌中的表达和功能有助于鉴定新型乳腺癌标志物和治疗靶点。E2F3为E2F家族中的重要成员,编码产物为E2F3蛋白,包括E2F3a和E2F3b两亚基。E2F3充当细胞周期进程的强力转录诱导因子,一般情况下是和细胞周期蛋白D1形成二聚体,以参与调节细胞周期。研究证实,E2F3在包括肾癌、乳腺癌、胃癌和宫颈癌等各种癌症中的表达增加。有文献报道,E2F3作为miR-200c的靶基因调控肾癌、膀胱癌细胞生长和运动,但在乳腺癌中miR-200c与E2F3的靶向关系如何及有关作用机制的研究尚未见报道。我们借助KEGG Pathway数据库,分析后得出PI3K/AKT通路是E2F3的调控机制。在乳腺癌中,以PIK3CA和AKT癌基因突变,RTKs过表达和PTEN肿瘤抑制功能丧失等多种方式实现对PI3K/AKT通路的依赖作用。现有的研究提出E2F3调控PI3K/AKT通路在多种肿瘤中发挥促癌作用,但是PI3K/AKT信号通路是否为miR-200c调控E2F3影响乳腺癌细胞生物学特征的途径及有关作用机制,有待进一步探讨。研究目的:1.探索乳腺癌细胞中miR-200c和E2F3的表达特征;2.探索miR-200c与E2F3在乳腺癌中的靶向关系;3.探索上调和下调miR-200c表达水平对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等相关特征的影响;4.探索miR-200c调控E2F3通过PI3K/AKT通路在乳腺癌中发挥作用的可能机制。研究方法:1.miR-200c,E2F3在乳腺癌中的表达采用qRT-PCR技术、Western blot技术检测在MCF-10A、MDA-MB-231、MCF-7细胞系中miR-200c和E2F3的表达。2.miR-200c与E2F3的作用关系（1）通过Target Scan、mir DIP、miRWalk三个软件预测miR-200c与E2F3之间存在结合位点,E2F3为miR-200c的候选靶基因。（2）转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,首先利用qRT-PCR技术验证转染成功。然后利用qRT-PCR技术和Western blot技术分别检测E2F3在m RNA和蛋白质水平的表达变化。进一步检测miR-200c和E2F3之间的靶向关系。3.miR-200c对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7增殖、迁移、侵袭和凋亡特征的影响（1）转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,首先利用CCK-8实验研究miR-200c对细胞增殖能力的影响,另外利用Western blot技术分析增殖相关蛋白Ki-67、PCNA的表达变化。（2）转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,利用细胞划痕实验研究miR-200c对细胞迁移能力的影响。（3）转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,利用Transwell实验研究miR-200c对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,另外利用Western blot技术分析侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达变化。（4）转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,利用Hoechst染色实验观察荧光显微镜下致密亮蓝色荧光强度判断凋亡情况,另外利用Western blot技术分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达变化。4.miR-200c通过调节E2F3的表达对PI3K/AKT信号通路的影响转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor进入乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中,利用Western blot技术分析细胞内E2F3及PI3K/AKT信号通路中相关分子的表达变化。研究结果:1.以MCF-10A中的miR-200c在RNA水平的表达,E2F3在RNA和蛋白质水平的表达为对照,MDA-MB-231和MCF-7中miR-200c的表达降低,E2F3的表达增高。2.miR-200c和E2F3之间存在互补的结合位点,E2F3是miR-200c的候选靶基因。在MDA-MB-231和MCF-7中,上调miR-200c后E2F3的表达下降,下调miR-200c后E2F3的表达增高,两者的表达呈负相关。3.上调乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-200c的表达水平发现,细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱,凋亡能力增强;下调乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-200c的表达水平,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,凋亡能力减弱。4.上调乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-200c的表达水平发现,E2F3的表达下降,然后PI3K/AKT信号通路中p-PI3K、p-AKT分子的表达下降,细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱,凋亡能力增强;下调乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-200c的表达水平发现,E2F3的表达升高,然后PI3K/AKT信号通路中p-PI3K、p-AKT分子的表达升高,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,凋亡能力减弱。结果表明,miR-200c可以调节乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中E2F3的表达水平,并可能通过PI3K/AKT信号通路影响细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的特征。研究结论:1.miR-200c在乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中低表达,E2F3在乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中高表达。2.上调miR-200c的表达可抑制乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力,促进凋亡;下调miR-200c的表达可促进乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力,抑制凋亡。3.miR-200c可能与E2F3 3,UTR结合,靶向调控E2F3的表达,并通过PI3K/AKT信号通路影响乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。综上所述:本研究表明,miR-200c在乳腺癌细胞中发挥肿瘤抑制基因的作用。miR-200c通过调节E2F3的表达,影响乳腺癌细胞的恶性生物学行为,可能成为乳腺癌诊断治疗的新的生物标志物。