【摘 要】
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研究背景及目的:子痫前期可以导致早产、胎儿宫内生长受限、胎盘早剥和多脏器损伤等,目前仍是全球范围内妊娠妇女围产期死亡的主要因素之一。病因及发病机制目前仍不清楚,故尚无有效的治疗方法。很多学者认为子痫前期发病的重要原因是滋养细胞的侵袭能力异常和胎盘血管的重铸障碍。近年来研究表明胎盘滋养细胞侵袭和迁移能力的增加对螺旋动脉的重塑有利,滋养细胞侵袭异常导致的胎盘浅着床与子痫前期的发病密切相关,多种分子参与
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研究背景及目的:子痫前期可以导致早产、胎儿宫内生长受限、胎盘早剥和多脏器损伤等,目前仍是全球范围内妊娠妇女围产期死亡的主要因素之一。病因及发病机制目前仍不清楚,故尚无有效的治疗方法。很多学者认为子痫前期发病的重要原因是滋养细胞的侵袭能力异常和胎盘血管的重铸障碍。近年来研究表明胎盘滋养细胞侵袭和迁移能力的增加对螺旋动脉的重塑有利,滋养细胞侵袭异常导致的胎盘浅着床与子痫前期的发病密切相关,多种分子参与滋养细胞的侵袭。ELABELA（ELA）是近年来研究发现的一类APJ（Apelin受体）的内源性配体。近年来发现,ELA及其受体除在心血管疾病等方面具有生理调节作用外,还在胚胎发育、胚胎干细胞自我更新及卵巢癌等方面,也具有重要的生理学功能。MMP9已被证实与滋养细胞侵袭功能密切相关。本研究前期结果表明,ELA m RNA及蛋白在子痫前期病人胎盘组织中表达明显降低,提示ELA参与子痫前期的发病。子痫前期胎盘组织中MMP9 m RNA及蛋白表达明显降低,且MMP9蛋白表达与ELA蛋白表达呈正相关,表明ELA可能是通过影响滋养细胞侵袭参与在子痫前期发病过程中,具体机制尚不清楚。ELA可以通过PI3K/AKT信号通路促进胚胎干细胞的自我更新。越来越多的证据表明AKT信号通路在多种肿瘤中被激活,并促进细胞的侵袭和远处转移。在大鼠骨髓间充质干细胞发现ELA激活AKT并促进间充质干细胞的增殖和迁移。已有研究发现AKT信号通路可介导子痫前期,本研究提出ELA可能通过AKT信号通路影响滋养细胞的侵袭参与子痫前期的发病,旨在研究ELA对妊娠滋养细胞侵袭行为的影响以及其参与子痫前期可能的作用机制。研究方法:1、实时定量PCR法检测JEG-3细胞及Bewo细胞中ELA的表达量,筛选ELA表达量较高的细胞作为实验所用细胞系。2、将细胞用si RNA带有红色荧光集团（cy3）转染48小时,48h后于倒置显微镜下对其转染效率进行详细观察。3、将细胞分为3组,si-ELA组（转染组）,阴性对照组（细胞转染无意义序列组）及空白组,采用实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）对转染后各组细胞中ELA m RNA的表达程度进行检测并明确沉默效率。4、将细胞分为2组,si-ELA组和空白组。转染48小时后,细胞划痕实验及Transwell迁移实验对转染后各组细胞的迁移能力情况进行检测;Transwell侵袭实验对细胞的侵袭能力情况进行检测。5、细胞分为2组,si-ELA组和空白组,应用蛋白质免疫印迹法检测转染24小时后,Bewo细胞si-ELA组及空白组中p-AKT及MMP9蛋白的表达水平。6、数据采用Graph Pad Prism8软件进行t检验统计分析,P＜0.05表示差异具有一定的统计学意义。研究结果:1、Bewo细胞中ELA的表达量较JEG-3细胞中更高,故选择Bewo细胞作为研究细胞。2、用si RNA转染Bewo细胞,细胞转染48小时后于荧光显微镜下随机地抽取4个视野计数转染细胞及未转染细胞,取平均值计算得到转染效率,计算得出转染效率达90%以上。3、通过实时荧光定量PCR对各组中ELA m RNA的表达水平进行测定:si-ELA组的ELA m RNA表达量明显低于si-NC组及空白组（低于si-NC组:t=53.55,P＜0.0001;低于空白组:t=28.02,P＜0.0001）,且si-NC组与空白组无统计学意义（t=1.19,P＞0.05）4、si-ELA组细胞的迁移能力较空白对照组低（t=4.74,P＜0.01）。Transwell实验中,转染组5个视野穿过细胞膜的平均值低于空白组（t=6.46,P＜0.01）。就迁移能力对比情况来看,si-ELA组滋养细胞较空白对照组明显更低（P＜0.01）。在Transwell侵袭实验中,就细胞侵袭能力对比情况来看,si RNA-ELA组滋养细胞较空白对照组明显更低（t=8.60,P=0.001）。以上实验过程均进行3次重复（n=3）。表明敲低ELA后滋养细胞迁移及侵袭能力明显下降。5、敲低ELA后,si-ELA组p-AKT、MMP9蛋白表达程度较空白对照组明显更低（p-AKT t=10.08,P＜0.01;MMP9 t=39.61,P＜0.001）,就统计学来讲,其差异具有显著意义。表明ELA能够下调p-AKT及MMP9蛋白水平,提示ELA可能通过AKT信号通路对滋养细胞的迁移和侵袭能力产生影响。结论:1、ELA参与Bewo细胞的迁移和侵袭。2、ELA通过AKT信号通路对Bewo细胞的迁移和侵袭能力产生影响。综上所述,ELA可能通过AKT信号通路影响滋养细胞的迁移和侵袭,参与子痫前期的发病。
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