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阿尔茨海默氏病（Alzheimer disease,AD）是一种神经退行性疾病,其患病率随着年龄的增长而持续增加。随着全球人口老龄化进程日益加快,开发治疗AD的药物显得尤为重要。AD是一种多因素疾病,由此出现了多种解释AD发病机制的假说,其中被人们广泛接受的是淀粉样蛋白级联假说。该假说认为β-淀粉样蛋白1-42（Aβ42）的沉积可导致Tau蛋白过度磷酸化、突触消失和神经变性,最终导致认知功能障碍。Aβ42是由β-分泌酶和γ-分泌酶顺序切割APP产生的,具有强烈的自我聚集倾向,依次聚集形成Aβ42寡聚体、原纤维、纤维和淀粉样斑块,其中Aβ42寡聚体与AD的发展密切相关。在骆驼科动物体内存在着天然的单域抗体,即可变重链结构域（variable heavy chain domains,VHH）,它能够到达传统抗体无法靠近的抗原蛋白分子中隐藏的表位,与抗原具有高亲和性,同时具有更高稳定性。因此,单域抗体已成为免疫治疗和诊断过程中强有力的工具。在前期研究中,我们已从人抗体库中筛选出抗Aβ42寡聚体的单链抗体AS[89],它能够识别并特异性结合中等大小的Aβ42寡聚体和未成熟的原纤维,并抑制其形成或诱导其解聚。同时,单链抗体AS能够抑制并中和Aβ42细胞的毒性。而单链抗体AS的VH（重链可变区）和VL（轻链可变区）与Aβ42之间的作用方式和作用位点存在一定的差异。因此,为了进一步分析单链抗体AS分子中的VH、VL结构域作为单域抗体的功效,本论文制备了单链抗体AS分子的单一结构域VH、VL的制剂,同时依据鼠源Aβ42的一级结构,对人Aβ42的N端5到7位氨基酸进行定点突变（5RHD7→5GRN7）,获得Aβ42的突变体Aβ42#。本论文以Aβ42和Aβ42#为靶标,分别在分子水平和细胞水平上对比分析了单链抗体AS及其VH、VL结构域的性质与功能,AS、VH和VL对Aβ42及其聚集体的靶向作用与靶细胞的保护功效。本论文取得了如下结果:（1）运用重叠延伸聚合酶链式反应（splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE PCR）的方法构建了Aβ42的突变体Aβ42#的表达载体,并分别通过基因工程表达和纯化制备了单链抗体AS、单域抗体VH和VL,Aβ42和Aβ42#制剂。（2）采用间接ELISA法测定了单链/单域抗体（AS、VH、VL、VH＆VL）与Aβ42和Aβ42#寡聚体的结合特异性。结果显示:VH、VL与AS均对Aβ42的寡聚体有较强的结合性,对Aβ42原纤维有较低的结合性,而对Aβ42单体和纤维形式只有极低的结合性。比较发现,VL结构域对Aβ42寡聚体的结合性明显高于AS（p＜0.05）,而VH对Aβ42的四种形式（单体、寡聚体、原纤维和纤维）的结合性均明显低于AS。（3）通过间接ELISA法测定了单链/单域抗体（AS、VL、VH、VH＆VL）对Aβ42或Aβ42#寡聚体的（表观）结合力。结果显示,这些抗体与Aβ42寡聚体的结合力均在纳摩尔水平（0.625n M）,说明它们均可在n M级别有效结合Aβ42寡聚体。相比之下,这些抗体与Aβ42#结合力却需要在1μM水平左右。这表明Aβ42的N端5到7位氨基酸是这些抗体识别与结合所必需的。（4）通过间接竞争ELISA法测定了单链/单域抗体（AS、VL、VH、VH＆VL）与Aβ42或Aβ42#寡聚体的（表观）亲和力常数（平衡解离常数,KD）。与Aβ42寡聚体的KD分别为6.0×10-6M、5.59×10-6M、6.7×10-5M和6.38×10-5M,亲和力大小:VL＞AS＞VH＆VL＞VH。与Aβ42#寡聚体的KD分别为20M、24M、21M和21M。由此证明了,VH、VL与AS相似,对Aβ42寡聚体具有较高的亲和力。（5）采用ThT-F和western blot方法分析发现,VH、VL与AS相似,它们均能抑制Aβ42的聚集并诱导Aβ42寡聚体和原纤维的解聚,但单域抗体VH对较小Aβ42形式（如单体、寡聚体）的聚集有更显著的抑制作用,而对于抑制较大Aβ42形式（如原纤维）的聚集来说,需要VH与VL的共同作用（游离的或由接头肽连接的）。（6）采用MTT法分析了单链/单域抗体（AS、VL、VH、VH＆VL）对靶细胞的保护作用,结果发现:VH、VL与AS相似,它们均能有效抑制Aβ42寡聚体的细胞毒性,而且它们的功效无显著差异。综合单链抗体AS与Aβ42的分子对接和本论文研究结果可知:单链抗体AS主要通过VL结构域与Aβ42相互识别并结合,并主要通过VH结构域发挥其抑制Aβ42的聚集并诱导Aβ42寡聚体或原纤维的解聚的功效,但VH与VL的共同作用对抑制Aβ42的聚集更有效。然而,VH与VL均能以各自与Aβ42寡聚体相互作用的方式发挥抑制Aβ42寡聚体细胞毒性的功效。本论文的研究结果将为进一步推进靶向β-淀粉样蛋白单域抗体的研究、为获得更有效的抗Aβ42免疫疗法治疗AD的药物奠定理论和实践基础。