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目的:通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、CCK-8法、扫描电镜观察(Scanning election microscopy,SEM)等实验方法,分析对比应用手动刮治器械、Er:YAG激光和双波长激光辅助治疗中重度慢性牙周炎的临床效果及龈沟液中白介素--1β(Interleukin-1β,IL-1β)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)水平的变化,制备牙骨质片,观察不同方法处理后的根面形态,并将原代培养的人牙龈成纤维细胞接种于其上,检测人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)在不同根面的初期黏附、增殖情况及细胞生长形态,探讨与手动刮治器械和Er:YAG激光相比,双波长激光处理对HGFs在根面附着的影响及其作用机制,为双波长激光辅助牙周治疗促进形成牙周新附着提供理论依据和实验数据。方法:1.纳入35例慢性牙周炎患者,龈上洁治术后随机分为三组:刮治与根面平整(Scaling and root planning,SRP)组、Er:YAG激光龈下刮治及根面平整(Er:YAG Laser Therapy,ERL)组、双波长激光(Er:YAG激光+Nd:YAG激光)龈下刮治及根面平整(Twinlight Laser Therapy,TPT)组,观察并记录龈上洁治后一周(基线)、治疗后6周、12周的探诊深度(Probing depth,PD)、临床附着丧失(Clinical attachment level,CAL)及出血指数(Bleeding index,BI)的变化,并采集患者龈沟液应用ELISA法测量其炎症细胞因子IL-1β和MMP-9含量的变化。应用SPSS 21.0软件进行重复测量方差分析。2.选择因重度慢性牙周炎拔除的无保留价值的患牙制备牙骨质根片,分别进行机械SRP处理、Er:YAG激光照射处理和双波长激光(Er:YAG激光+Nd:YAG激光)照射处理,扫描电镜下观察三组根面形态;采用组织块法,体外原代培养HGFs,传代后进行抗波形蛋白、角蛋白免疫组化染色以鉴定细胞来源,并采用CCK-8法描绘细胞生长曲线;并将HGFs分别接种至三组不同处理后的样本表面,采用CCK-8法测定HGFs的黏附、增殖情况,并观察各组样本表面HGFs的细胞形态。结果:1.临床指标:共有472颗患牙的2832个位点纳入临床观察,三组在治疗后牙龈炎症得到控制,牙龈红肿基本消退,由深红色外观变为粉红色,出血量明显减少,牙龈质地较治疗前坚韧。三组治疗前后进行重复测量方差分析,结果显示组别与时间点存在交互作用(P<0.05)。基线时(T1)三组临床指标差异无统计学意义(P>0.05)。三组内检测临床指标在不同时间点差异具有统计学意义(P<0.05),各组的临床指标在T2、T3均低于T1(P<0.05)。T2、T3时,三组间PD、CAL、BI检测值差异有统计学意义(P<0.05),TPT组各指标均低于另外两组(P<0.05),而ERL组各指标与SRP组差异无统计学意义(P>0.05)。2.龈沟液中IL-1β、MMP-9含量的变化:经重复测量方差分析发现不同时间与组别间存在交互作用(P<0.05),进一步分析单独效应,三组基线龈沟液中IL-1β、MMP-9含量差异无统计学意义(P>0.05),T2、T3时三组龈沟液中IL-1β、MMP-9含量差值均有统计学意义(P<0.05),TPT组龈沟液中IL-1β、MMP-9含量均显著低于ERL组合SRP组(P<0.05),ERL组IL-1β、MMP-9含量显著低于SRP组(P<0.05)。3.扫描电镜根面形态观察SRP组:根面形态光滑平坦,可见划痕、玷污层及散在细小牙石,有牙骨质剥脱痕迹,未见牙本质小管暴露。ERL组:根面呈现较为均匀的粗糙形貌,未见明显熔融、碳化、划痕、裂纹以及玷污层存在,表面呈明显的颗粒状突起,牙骨质部分消融,无熔融矿物质沉积。TPT组:根面呈现不均匀的粗糙形貌,可见不同程度的牙体硬组织的消融,牙本质小管呈现部分熔融或封闭,有少量玷污层存在,组织无碳化,存在熔融矿物质沉积。4.HGFs在不同处理方式根面的黏附、增殖结果:体外培养的HGFs表现为典型的成纤维细胞形态,免疫细胞化学染色显示细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。HGFs在各组样本表面培养2小时相对粘附率(%)均值具有统计学意义(P<0.05),ERL组相对黏附率为35.10±1.08,显著高于其他两组(P<0.05)。HGFs在各组样本表面增殖情况总体呈现先上升后平缓下降的趋势,SRP组在第1天OD值明显小于ERL组和TPT组(P<0.05),而ERL组和TPT组差异无统计学意义(P>0.05),其他时间点三组结果进行两两分析均有统计学意义(P<0.05)。ERL组HGFs增殖能力显著优于TPT组,TPT组HGFs增殖能力显著优于SRP组(P<0.05)。SEM观察:SRP组表面细胞较为稀疏,且细胞伸展较差,细胞呈扁平形甚至圆形,伸出的伪足少且短,细胞外基质分泌较少。ERL组HGFs与样本表面黏附较好,细胞密集,细胞伸出伪足向四周均匀铺开,细胞之间伪足交织成网状,紧密黏附于样本表面,放大后可见附着的细胞胞体丰满,伸展良好,粗糙样本表面布满细胞外基质。TPT组HGFs各视野细胞数目少于ERL组,伸出伪足较少较细长,有的伸入周围间隙中固定牢固,细胞伸展范围较小,放大后可见黏附细胞形态呈狭长三角形或多角形。结论:1.SRP治疗和激光治疗都能有效控制和消除炎症,降低龈沟液中IL-1β、MMP-9的含量。2.与手用器械相比,双波长激光处理可以更有效地保存根面组织,提高根面生物相容性,Er:YAG激光更适用于处理根面硬组织。3.双波长激光辅助牙周治疗,有助于提高HGFs在根面的黏附与增殖,促进牙周新附着的形成,但应避免由激光照射方向改变造成的损伤。