α-酮异戊酸（α-ketoisovalerate）作为一种重要的药物中间体,是α-酮酸片的主要成分之一,被广泛应用于医药领域,在治疗慢性尿毒症方面具有重要的作用。利用代谢工程策略改造微生物菌株,高效发酵合成α-酮异戊酸,具有较大的经济价值和社会意义。本研究通过静态代谢工程策略弱化竞争代谢途径、动态调控菌体生长代谢途径以及平衡辅酶循环系统等,实现了α-酮异戊酸在大肠杆菌（Escherichia coli）中的高效发酵合成,并且简化了发酵工艺、降低了菌体生长代谢的营养需求。具体研究内容如下:（1）静态代谢工程策略弱化竞争代谢途径。出发菌株E.coli 050T4/p CTSDT在5 L发酵罐中,利用有机氮源发酵,α-酮异戊酸产量为46.4 g·L-1,副产物异丁醇积累为13g·L-1。为了减少异丁醇积累量,改造了α-酮异戊酸合成途径中关键酶乙酰乳酸合成酶（Als S）,降低其以α-酮异戊酸为底物合成异丁醛的酶活性,并优化该酶的核糖体结合位点序列,得到菌株050T4/p CTSDTQ487S-RBS55,其摇瓶发酵α-酮异戊酸产量和出发菌株相当,副产物异丁醇积累量比出发菌株减少了56.3%。为进一步提高α-酮异戊酸产量及转化率,在丙酮酸脱氢酶（pdh）C端融合降解标签DAS+4,弱化三羧酸循环（TCA）,得到菌株050TY。通过摇瓶发酵优化菌株050TY/p CTSDTQ487S-RBS55的供氧强度和诱导时机,α-酮异戊酸产量比出发菌株提高了14.8%;其5 L发酵罐发酵产量达到55.8g·L-1,副产物异丁醇积累量仅为1.5 g·L-1。（2）结合CRISPRi技术与降解标签动态调控菌体生长代谢途径。由于菌株050T4及050TY敲除了缬氨酸、亮氨酸途径,为营养缺陷型菌株。为了利用基本培养基发酵合成α-酮异戊酸减少菌体生长的营养需求,本研究在缬氨酸原养型菌株B0016-050的染色体上pox B基因处整合T7 RNA聚合酶编码基因,获得菌株050Y/p CTSDT,作为动态调控的出发菌株。利用CRISPRi技术与DAS+4降解标签组合抑制ilv E基因的表达和残留酶活性,以动态调控缬氨酸合成水平,并优化dcas9基因的启动子及其操纵基因,得到重组菌株050Y2/p CTSDT+p ACYC-trc-dcas9-444;该菌株α-酮异戊酸产量为12.4 g·L-1,缬氨酸积累量仅为0.05 g·L-1。进一步,利用CRISPRi技术与降解标签抑制pdh,以动态调控TCA循环,得到重组菌050Y3/p CTSDT+p ACYC-trc-dcas9-444-478;该菌株利用无机盐培养基发酵合成α-酮异戊酸产量提高为15.8 g·L-1,比菌株050Y/p CTSDT产量提高了58%,缬氨酸副产物积累量减少98.7%。（3）平衡辅酶循环系统。α-酮异戊酸合成途径中,产生2分子NADH,同时消耗1分子NADPH。本文通过加强吡啶核苷酸转氢酶（pnt AB）的基因启动子强度,以加强NADPH的再生系统,得到重组菌株050Y4/p CTSDT+p ACYC-trc-dcas9-444-478;该菌株α-酮异戊酸产量增加至17.1 g·L-1,比重组菌050Y3/p CTSDT+p ACYC-trc-dcas9-444-478提高10%。最终,组合上述最优策略,得到菌株050Y4/p CTSDTQ487S-RBS55+p ACYC-trc-dcas9-444-478,利用无机盐培养基发酵α-酮异戊酸产量为16.5 g·L-1,副产物异丁醇积累量为0.52 g·L-1;5 L发酵罐发酵产量达到35.2 g·L-1,异丁醇积累量为1.2 g·L-1。