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目的:筛选与白及次生代谢产物Coelonin、Dactylorhin A和Militarine合成积累相关的调控基因,分析4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase,4CL）基因对于白及次生代谢产物合成的调控机制,并探索农杆菌介导的白及愈伤组织遗传转化和磁性纳米材料介导的白及原生质体遗传转化的条件。方法:1.候选基因筛选与表达分析应用R语言筛选白及细胞悬浮培养过程中与Coelonin、Militarine和Dactylorhin A合成相关的候选基因,用q PCR验证重要候选基因在悬浮培养不同阶段的表达量和在白及植株不同组织器官的表达模式,并对候选基因进行了基因克隆,构建了候选基因与绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）基因融合表达的过表达重组质粒。2.调节白及次生代谢产物合成的4CL基因家族分析利用生物信息学分析方法对白及4CL基因家族（Bs4CL）的蛋白一级结构、二级结构、基序和KEGG富集结果等进行了分析,应用EST-SSR检测了在不同白及品系中Bs4CL的遗传多态性,通过相关性分析探究Bs4CL基因在次生代谢产物中的调控作用,用q PCR技术分析BS4CL基因家族的表达模式。3.白及愈伤组织的遗传转化体系构建在白及愈伤组织继代培养基中添加0、0.1、0.3、0.5 mg/L草胺磷探究最适的草胺磷筛选浓度。再将pCB2004-35S-HDG11表达载体转化到EHA105、LBA4404和GV3101农杆菌感受态细胞中,培养阳性克隆菌侵染愈伤组织,再通过共培养、脱菌、筛选培养、愈伤组织增殖培养、芽增殖培养和生根壮苗培养,建立农杆菌介导的白及愈伤组织遗传转化体系,并提取抗草铵膦（Phosphinothricin,PPT）的白及幼苗的DNA进行HDG11基因的PCR检测。4.白及原生质体的遗传转化体系构建通过低温黑暗和甘露醇的预处理,以10 mL/g的比列加入酶解液,25℃、50 rpm黑暗酶解4 h。并通过200目细胞筛过滤和清洗液清洗纯化原生质体。采用不同浓度的纤维素酶、果胶酶和离析酶进行组合,筛选适合白及愈伤组织分离的酶解液配比。取100μL含量为5×105个/mL以上的白及原生质体与10μL质量比为1:5的磁性纳米颗粒和p BI221-GFP表达载体的复合物混匀,通过磁场静置诱导转化30 min,然后清洗、加KM8P培养基暗培养,培养48h观察GFP基因表达情况。结果:1.白及转录组数据库的调控基因的筛选与分析通过白及悬浮培养细胞不同生长时期的差异基因表达与次生代谢产物积累的相关性分析,筛选了与Coelonin、Militarine、Dactylorhin A合成相关的已知合成途径中的38个基因,29个转录因子基因,85个未知基因,其中,部分基因同时关联多个次生代谢产物的合成。挑选了其中的3个BsMYB、BsUP1和BsUP2基因进行了克隆,表达模式分析发现这3个基因在白及不同组织部位的表达具有明显差异性。2.白及4CL基因家族的鉴定与表达分析通过分析上述152个基因的注解信息,发现其中的4CL基因家族与次生代谢物合成以及细胞的生长发育密切相关,深入分析发现基于白及悬浮培养细胞的转录组数据库中21个4CL同源基因。KEGG富集分析发现白及4CL基因家族主要参与了脂质代谢、α-亚麻酸代谢、氨基酸新陈代谢、苯丙烷生物合成以及其他次生代谢物的生物合成等过程。通过EST-SSR检测发现Bs4CL基因在3个白及地方品种中呈现遗传多态性,q PCR分析发现Bs4CL基因在白及不同组织部位的表达水平具有较大的差异,其中Bs4CL2基因在白及根和块茎中表达最高。通过将Bs4CL基因的相对表达量与Coelonin、Dactylorhin A和Militarine的含量进行相关性分析发现,4CL基因在Coelonin、Dactylorhin A和Militarine的合成中发挥着重要调控作用。3.白及愈伤组织的遗传转化体系构建建立白及遗传转化体系有助于进一步探究候选基因的功能和作用机制。本研究通过p CB2004-35S-HDG11表达载体构建了基于农杆菌介导法的白及愈伤组织遗传转化体系,再经PCR检测具有PPT抗性的遗传转化苗的HDG11基因,发现其阳性率分别为1.1%、14.4%和14.4%。4.白及原生质体的遗传转化体系探究建立了原生质体的分离体系（1.5%Cellulase R-10+0.4%Pectolyase Y-23+0.5%Macerozyme R-10）,以悬浮培养细胞进行提取得到含量为6.33×10~5个/mL,活力率为86.99%的原生质体。利用磁珠法构建了原生质体的遗传转化,实现了GFP基因在原生质体中的表达,通过显微观察其转化率为47.86%。结论:本研究筛选出的152个基因参与调控了白及次生代谢产物Coelonin、Dactylorhin A和Militarine的合成积累,进一步分析发现Bs4CL基因家族参与了白及的生长发育和次生代谢产物的生物合成途径。构建了农杆菌介导的白及愈伤组织遗传转化体系,并初步构建了白及悬浮培养细胞的原生质体分离体系,以及磁性纳米颗粒介导的原生质体遗传转化体系。