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目的:1、检测绿原酸（CGA）或西红花苷（CRO）或联合用药（CGA+CRO）对鹅去氧胆酸（CDCA）刺激的人肝癌细胞（Hep G2）通过FXR和TGR5信号途径对脂质积聚,胆汁酸受体和转运体的表达,炎症因子的影响;2、研究CGA/CRO/CGA+CRO对CDCA刺激的小鼠小肠内分泌细胞（STC-1）通过FXR和TGR5信号途径对脂质积聚,胆汁酸受体和转运体的表达,炎症因子的影响。方法:1、CGA和CRO对Hep G2细胞FXR和TGR5信号途径的影响（1）CDCA刺激Hep G2细胞,分别加入FXR受体激动剂GW4064或抑制剂Gly-β-MCA,TGR5受体激动剂INT777或抑制剂SBI-115以及CGA或CRO或CGA+CRO孵育细胞,测定下列指标:（2）MTT法检测细胞增殖率,药物量效和时效关系。（3）油红染色法观察细胞内脂滴积聚,定量分析总脂质和总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）含量。（4）ELISA法检测总胆汁酸（TBA）含量和胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）酶活性。（5）ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、巨噬细胞半乳糖型C型凝集素1（MGL-1）、M2型巨噬细胞标志物CD206、抵抗素样分子α（RELMα）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）含量。（6）免疫组化检测ATP结合转运蛋白G5（ABCG5）、ATP结合转运蛋白G8（ABCG8）蛋白的表达。（7）实时荧光定量PCR法检测胆汁酸盐输出泵（BSEP）、多耐药相关蛋白2/3（MRP2/3）、有机溶质转运体α/β（OSTα/β）、牛磺胆酸钠共运蛋白（NTCP）、有机阴离子转运多肽1B1/3（OATP1B1/3）的m RNA表达。（8）Western Blot法检测法尼醇X受体（FXR）、G-蛋白偶联受体（TGR5）、小异二聚体伴侣受体（SHP-2）和胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）的蛋白表达。2、CGA和CRO对STC-1细胞FXR和TGR5信号途径的影响（1）STC-1细胞分别转染过表达质粒（FXR、TGR5）和Sh RNA（FXR、TGR5）,荧光显微镜观察转染情况,流式细胞术检测转染效率。CDCA刺激转染后的STC-1细胞,再分别加入CGA或CRO或CGA+CRO孵育细胞,测定下列指标:（2）MTT法检测细胞增殖率及CGA/CRO/CGA+CRO的量效和时效关系。（3）油红染色法观察脂滴积聚,定量分析总脂质和TC、TG水平。（4）ELISA法检测胰高血糖素样多肽1（GLP-1）、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）和单核细胞趋化蛋白-1（CCL2、CCL3和CCL4）的含量。（5）实时荧光定量PCR法检测成纤维细胞生长因子15（FGF15）、成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）基因表达水平。（6）实时荧光定量PCR法检测顶端钠依赖性胆汁酸盐转运体（ASBT）、多耐药相关蛋白2/3（MRP2/3）、有机溶质转运体α/β（OSTα/β）、回肠胆汁酸结合蛋白（IBABP）的m RNA表达。（7）Western Blot法检测胆汁酸受体（FXR、TGR5）和SHP-2的蛋白表达。结果:1、CGA和CRO通过FXR和TGR5信号途径减轻CDCA对Hep G2细胞的毒性（1）根据MTT结果,选择合适药物浓度如下:CDCA:50.0μM;CRO:10.0μM;CGA:50.0μM;CGA+CRO:50.0μM+10.0μM;GW4064:1.0μM;Gly-β-MCA:1.0μM;INT777:3.0μM;SBI-115:1.0μM,上述各药物均孵育24h。（2）经CDCA刺激后,细胞内的中性脂滴和脂质积聚（总脂质、TC和TG）显著增加;CGA/CRO/CGA+CRO均能显著抑制CDCA诱导后的细胞内各种脂质积聚,且CGA+CRO效果更优;GW4064/INT777能显著抑制并明显增强CGA/CRO/CGA+CRO抑制脂质积聚的作用,且各激动剂联合CGA+CRO的效果更优。Gly-β-MCA能显著下降细胞内总脂质,Gly-β-MCA/SBI-115也能阻断CGA/CRO/CGA+CRO对各种脂质积聚的抑制作用。（3）CDCA显著降低细胞中抗炎因子（IL-10、CD206、MGL-1）的含量,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,恢复抗炎因子水平;GW4064/INT777对CDCA的抑制作用无显著影响,但可以显著增强CGA/CRO/CGA+CRO的抗炎作用,且各激动剂联合CGA+CRO作用更强。Gly-β-MCA/SBI-115对CDCA降低抗炎因子含量无显著影响,但能阻断CGA/CRO/CGA+CRO的抗炎作用。（4）CDCA显著增加细胞中促炎因子（TNFα、IL-6、IL-1β、MCP-1、RELMα）的含量和趋化因子（CCL2、CCL3、CCL4）的基因表达水平,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,降低促炎因子和趋化因子水平;GW4064/INT777对CDCA的促炎作用无显著影响,但可以显著增强CGA/CRO/CGA+CRO的抗炎作用,且各激动剂联合CGA+CRO抗炎作用更强。Gly-β-MCA/SBI-115对CDCA的促炎作用无显著影响,但能阻断CGA/CRO/CGA+CRO的抗炎作用。（5）CDCA显著增加FXR蛋白表达,轻度增加TGR5蛋白表达但无显著影响;GW4064/INT777和CGA+CRO均能显著增强CDCA促表达作用,且各激动剂显著增强CDCA+CGA/CRO/CGA+CRO促FXR、TGR5蛋白表达作用;Gly-β-MCA对CDCA促FXR蛋白表达无影响,但明显阻断CDCA+CGA+CRO促FXR蛋白表达的作用;SBI-115显著抑制CDCA和阻断CDCA+CGA/CRO/CGA+CRO促TGR5蛋白表达作用。CDCA显著抑制SHP-2蛋白表达,而GW4064/INT777和CGA/CRO/CGA+CRO均能对抗CDCA的作用,增强SHP-2蛋白表达,同时GW4064/INT777显著增强CGA/CRO/CGA+CRO的作用,且各激动剂联合CGA+CRO促进SHP-2蛋白表达更显著。Gly-β-MCA/SBI-115能一定程度阻断CGA/CRO/CGA+CRO激动SHP-2蛋白表达的作用。（6）CDCA显著增强细胞中CYP7A1酶活性、蛋白表达和TBA含量,而GW4064/INT777和CGA/CRO/CGA+CRO均能显著抑制CDCA的作用,降低CYP7A1酶活性、蛋白表达和TBA含量,同时GW4064/INT777显著增强CGA/CRO/CGA+CRO的抑制作用,且各激动剂联合CGA+CRO抑制CYP7A1酶活性、蛋白表达和TBA含量的作用更强。Gly-β-MCA/SBI-115对CDCA刺激的CYP7A1酶活性、蛋白表达和TBA含量无显著影响,但能阻断CGA/CRO/CGA+CRO的抑制作用。（7）CDCA显著降低肝细胞中负责胆汁酸排出的转运体（BSEP、MRP2、MRP3、OSTα、OSTβ）m RNA表达水平,但对ABCG5和ABCG8蛋白表达水平影响不大,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗CDCA作用,恢复或增加上述7种转运体的表达水平,其中CGA+CRO的作用更强;GW4064也显著对抗CDCA的作用,明显增强转运体（MRP2/3、OSTα、ABCG5/8）的表达水平,同时协同CGA/CRO/CGA+CRO促进7种转运体表达的作用,且GW4064+CGA+CRO促表达作用更强;INT777显著促进并协同CGA/CRO/CGA+CRO增加OSTα/βm RNA和ABCG5/8蛋白表达的作用,而INT777+CGA+CRO显著增强BSEP和MRP2/3 m RNA表达。Gly-β-MCA/SBI-115对CDCA的抑制作用无显著影响,但能明显阻断CGA/CRO/CGA+CRO促进7种转运体基因/蛋白表达的作用。（8）CDCA显著增加肝细胞中负责胆汁酸吸收的转运体（NTCP、OATP1B1/3）m RNA表达水平,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,抑制上述转运体的基因表达,其中CGA+CRO作用更强;GW4064/INT777也显著抑制并明显协同CGA/CRO/CGA+CRO抑制上述转运体基因表达水平,且各激动剂联合CGA+CRO抑制作用更强。Gly-β-MCA/SBI-115对CDCA的上述促表达作用影响不大,但能明显阻断CGA/CRO/CGA+CRO的抑制作用。2、CGA和CRO通过FXR和TGR5信号途径减轻CDCA对STC-1细胞的毒性（1）荧光显微镜观察显示质粒及Sh RNA转染成功,流式细胞术检测FXR和TGR5的质粒（FXR/TGR5 Plasmid）转染效率分别为39.16%和41.24%,FXR和TGR5的Sh RNA转染效率分别为78.10%和82.59%。（2）根据MTT结果,选择合适药物浓度如下:CDCA:50μM;CRO:10μM;CGA:50μM;CGA+CRO:50μM+10μM。各药物孵育时间均为24h。（3）经CDCA刺激后,细胞内的中性脂滴和脂质积聚（总脂质、TC和TG）显著增加;CGA/CRO/CGA+CRO均能显著抑制CDCA诱导后的细胞内各种脂质积聚,且CGA+CRO效果更优;CGA/CRO/CGA+CRO均能明显增强FXR/TGR5 Plasmid抑制细胞内各种脂质积聚的作用,且FXR/TGR5 Plasmid+CGA+CRO的效果更优。FXR/TGR5 Sh RNA能降低CGA/CRO/CGA+CRO对细胞内各种脂质积聚的抑制作用,且FXR/TGR5 Sh RNA联合CGA+CRO的效果更优。（4）经CDCA刺激后,细胞分泌的GLP-1含量显著降低,而FXR Plasmid和CGA/CRO/CGA+CRO均能对抗该作用,TGR5 Plasmid对CDCA的抑制作用无显著影响,但FXR/TGR5 Plasmid可以显著增强CGA/CRO/CGA+CRO促GLP-1分泌的作用;FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA的刺激作用也无显著影响,但能阻断CGA/CRO/CGA+CRO促分泌作用。（5）经CDCA刺激后,细胞分泌的抗炎因子（IL-10）含量显著降低,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,恢复IL-10水平,其中CGA+CRO作用更强;FXR/TGR5 Plasmid显著增强CGA/CRO/CGA+CRO促进IL-10分泌的作用,且FXR/TGR5 Plasmid+CGA+CRO作用更强。FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA的刺激作用也无显著影响,但能降低CGA/CRO/CGA+CRO的促分泌作用。（6）经CDCA刺激后,细胞促炎因子（TNFα、IL-6、IL-1β）的含量和趋化因子（CCL2、CCL3、CCL4）的基因表达水平显著增加,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,其中CGA+CRO作用更强;FXR Plasmid显著抑制CDCA刺激3种促炎因子分泌的作用,但对3种趋化因子无影响,TGR5 Plasmid显著抑制CDCA刺激的TNFα、IL-6水平,但对IL-1β和3种趋化因子无影响,而FXR/TGR5 Plasmid可以增强CGA/CRO/CGA+CRO抑制3种促炎因子和3种趋化因子水平的作用,其中FXR/TGR5Plasmid+CGA+CRO抑制作用更强。FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA的刺激作用也无显著影响,但能降低CGA/CRO/CGA+CRO抑制抗炎因子和趋化因子的作用。（7）CDCA显著增加FXR蛋白表达,对TGR5蛋白表达无影响;FXR/TGR5 Plasmid显著增强并协同CDCA+CGA/CRO/CGA+CRO促FXR和TGR5表达作用;FXR/TGR5Sh RNA不影响CDCA对FXR和TGR5蛋白表达的作用,但能显著阻断CDCA+CGA/CRO/CGA+CRO促FXR和TGR5表达作用。CDCA明显抑制SHP-2蛋白表达,而FXR/TGR5 Plasmid和CGA/CRO/CGA+CRO能对抗CDCA的抑制作用,增强SHP-2蛋白表达,且FXR/TGR5 Plasmid+CGA/CRO/CGA+CRO促表达作用更显著。FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA抑制SHP-2蛋白表达的作用有一定程度增强作用,FXR Sh RNA显著阻断CGA/CRO/CGA+CRO的促SHP-2表达作用,而TGR5Sh RNA对CGA/CRO/CGA+CRO促SHP-2表达有增强作用。（8）经CDCA刺激后,FGF15、FGFR4基因表达无明显改变,而CGA/CRO/CGA+CRO能显著促进FGF15基因表达,CRO/CGA+CRO则能显著促进FGFR4基因表达,其中CGA+CRO作用更强。FXR/TGR5 Plasmid对CDCA的刺激作用无显著影响,但FXR/TGR5 Plasmid联合CGA/CRO/CGA+CRO能显著增强FGF15、FGFR4基因表达,且FXR Plasmid+CGA+CRO促表达作用更显著。FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA抑制FGF15、FGFR4基因表达作用影响不大,但能降低CGA/CRO/CGA+CRO的促表达作用。（9）经CDCA刺激后,负责胆汁酸排出的5种转运体（MRP2、MRP3、OSTα、OSTβ、IBABP）基因表达水平无显著性变化,而CGA/CRO/CGA+CRO能显著促进MRP2/3、OSTα、IBABP基因表达水平,CRO/CGA+CRO则能显著促进OSTβ基因表达水平,其中CGA+CRO的作用更强。FXR Plasmid明显增强OSTα/β、IBABP基因表达水平,TGR5 Plasmid显著促进OSTα基因表达,同时FXR/TGR5 Plasmid明显协同CGA/CRO/CGA+CRO促进5种转运体基因表达的作用,且FXR/TGR5Plasmid+CGA+CRO促表达作用更强;FXR/TGR5 Sh RNA对CDCA抑制5种转运体基因表达无显著影响,但能明显阻断CGA/CRO/CGA+CRO对上述转运体基因的促表达作用。（10）经CDCA刺激后,负责胆汁酸吸收的转运体ASBT基因表达水平显著增加,而CGA/CRO/CGA+CRO则能对抗该作用,抑制ASBT的基因表达;FXR/TGR5Plasmid和FXR/TGR5 Sh RNA均显著抑制并明显协同CGA/CRO/CGA+CRO的抑制作用,且FXR/TGR5 Plasmid联合CGA/CRO/CGA+CRO对ASBT基因表达的抑制作用更强。结论:采用药理学激动剂和阻断剂以及过表达质粒和基因敲低影响FXR和TGR5蛋白表达的方法,证明CGA和CRO是胆汁酸核受体FXR和TGR5的激动剂,且激动作用强于FXR/TGR5经典激动剂GW4064/INT777。CGA和CRO通过激动FXR/TGR5调控Hep G2肝细胞中SHP-2/CYP7A1和STC-1小肠内分泌细胞中SHP-2/FGF15/FGFR4信号通路,促进胆汁酸排出转运体和抑制胆汁酸吸收转运体的基因或蛋白表达,调节胆汁酸的肝肠循环、维持胆汁酸稳态,从而显著抑制CDCA刺激所致肝、肠细胞内脂质和胆汁酸的异常积聚及炎症因子和趋化因子的分泌,降低CDCA的毒性,且CGA+CRO具有显著协同作用。