论文部分内容阅读
目的:探讨膜联三肽对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用,并明确mito KATP及Sirt3是否参与膜联三肽对糖尿病大鼠的心肌保护作用。方法:选择SPF级雄性健康SD大鼠,体重为300g～350g,周龄为12～14周,建立为2型糖尿病模型,随机分为假手术组（Sham组）,心肌缺血再灌注损伤组（MIRI组）,心肌缺血再灌注损伤+膜联三肽组（MIRI+ANX组）,心肌缺血再灌注损伤+5-羟葵酸组（MIRI+5-HD组）,心肌缺血再灌注损伤+膜联三肽+5-羟葵酸组（MIRI+ANX+5-HD组）。Sham组为糖尿病大鼠不经历缺血;MIRI组为糖尿病大鼠结扎冠状动脉左前降支40min后再灌注3h;MIRI+ANX组为糖尿病大鼠结扎冠状动脉左前降支40min后再灌注3h,再灌注即刻尾静脉给予膜联三肽（1mg/kg）;MIRI+5-HD组糖尿病大鼠结扎冠状动脉左前降支40min后再灌注3h,再灌注即刻尾静脉给予5-HD（1mg/kg）;MIRI+ANX+5-HD组为糖尿病大鼠结扎冠状动脉左前降支40min后再灌注3h,再灌注即刻经尾静脉给予膜联三肽（1mg/kg）及5-HD（1mg/kg）。再灌注3h及术后24h:Elisa法检测血清中CK-MB、LDH含量检测,心肌组织中SOD、MDA含量,DHE法检测心肌组织ROS表达量,TTC染色法测定心肌梗死面积,电镜观察糖尿病大鼠心肌超微结构并进行线粒体评分,ATP试剂盒检测心肌组织ATP含量,超声心动图检测糖尿病大鼠心功能,Western-blot法检测Sirt3及mito KATP亚基Kir6.1表达量,免疫荧光双染法测量Sirt3在线粒体中的共定位。结果:1、各组糖尿病大鼠血清中心肌损伤标志物:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组CK-MB、LDH含量显著升高（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组CK-MB、LDH含量降低（P＜0.05）;MIRI+5-HD组CK-MB、LDH含量升高（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组CK-MB、LDH含量升高（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组CK-MB、LDH含量降低（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX+5-HD组相比,CK-MB、LDH含量无明显差异（P＞0.05）。2、各组糖尿病大鼠心肌氧化损伤指标:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组MDA、ROS含量显著升高,SOD含量降低（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组MDA、ROS含量降低,SOD含量升高（P＜0.05）;MIRI+5-HD组MDA、ROS含量升高,SOD含量降低（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组MDA、ROS含量升高,SOD含量降低（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组MDA、ROS含量降低,SOD含量升高（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX+5-HD组相比,MDA、SOD、ROS含量无明显差异（P＞0.05）。3、各组糖尿病大鼠心肌梗死面积测定:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组心肌梗死面积显著增加（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组心肌梗死面积减少（P＜0.05）,MIRI+5-HD组心肌梗死面积增加（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组心肌梗死面积增加（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组心肌梗死面积降低（P＜0.05）。再灌注3h及术后24h,MIRI组与MIRI+ANX+5-HD组心肌梗死面积均无明显差异（P＞0.05）。4、各组糖尿病大鼠心肌超微结构的改变及线粒体评分:（1）透射电镜下观测各组糖尿病大鼠心肌超微结构:Sham组线粒体双层膜结构较完整,呈稍肿胀样,线粒体嵴结构无明显破坏,心肌纤维排列规则,z线及明暗带清晰。MIRI组线粒体肿胀,膜结构消失,线粒体嵴变短变浅,基质内电子数量减少,心肌纤维排列稍紊乱,少部分溶解断裂。MIRI+ANX组较多数线粒体结构基本正常,排列未见明显紊乱,线粒体仍有肿胀,线粒体嵴基本存在,心肌纤维较MIRI组改善。MIRI+5-HD线粒体破坏溶解,残存线粒体结构不清,双层膜结构溶解,内呈空泡状,线粒体嵴结构严重损坏,心肌纤维溶解断裂成团,少见正常结构。MIRI+ANX+5-HD组线粒体肿胀甚至破裂,内外膜完整性缺失,线粒体嵴消失,肌纤维排列紊乱,z线及明暗带模糊。（2）各组糖尿病大鼠线粒体Flameng评分:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组Flameng评分增加（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组Flameng评分降低（P＜0.05）,MIRI+5-HD组Flameng评分增加（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组Flameng评分升高（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组Flameng评分降低（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX+5-HD组相比,Flameng评分无明显差异（P＞0.05）。5、各组糖尿病大鼠ATP含量测定:观察再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组ATP水平降低（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组ATP水平明显增加（P＜0.05）,MIRI+5-HD组ATP水平明显减少（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组ATP含量降低（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组ATP水平增加（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX+5HD组ATP水平无明显差异（P＞0.05）。6、各组糖尿病大鼠Sirt3及mito KATP亚基Kir6.1表达量:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组Sirt3表达量降低,Kir6.1表达量降低（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组Sirt3表达量升高,Kir6.1表达量升高（P＜0.05）;MIRI+5-HD组Sirt3表达量降低,Kir6.1表达量降低（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组Sirt3表达量降低,Kir6.1表达量降低（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组Sirt3表达量升高,Kir6.1表达量升高（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX组Sirt3及Kir6.1表达量无明显差异（P＞0.05）。7、各组糖尿病大鼠超声心动图:再灌注3h及术后24h,与Sham组相比,MIRI组EF、FS、LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs降低,而LVIDd、LVIDs增加（P＜0.05）。与MIRI组相比,MIRI+ANX组EF、FS、LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs增加,而LVIDd、LVIDs降低（P＜0.05）;MIRI+5-HD组EF、FS、LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs降低,而LVIDd、LVIDs增加（P＜0.05）。与MIRI+ANX组相比,MIRI+ANX+5-HD组EF、FS、LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs降低,而LVIDd、LVIDs增加（P＜0.05）。与MIRI+5-HD组相比,MIRI+ANX+5-HD组EF、FS、LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs增加,而LVIDd、LVIDs降低（P＜0.05）。MIRI组与MIRI+ANX+5-HD组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。8、Sirt3与COX IV线粒体定位:再灌注3h及术后24h时,Sham组,MIRI组,MIRI+ANX组,MIRI+5-HD组,MIRI+ANX+5-HD组的Sirt3均在心肌细胞线粒体内表达。结论:1、膜联三肽可能通过mito KATP调节Sirt3表达,维持线粒体功能,减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤。