研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）是起源于肝细胞的恶性肿瘤,是第六大最常见的癌症,位居癌症相关死亡第四位。肝细胞癌的发生是一个复杂的病理过程,常见的病因有慢性病毒感染、酒精、霉变物、毒物等,近年来非酒精性脂肪肝病相关HCC发病率呈上升趋势。我国是肝癌高发国家,肝癌是目前我国第四位常见恶性肿瘤,并在肿瘤致死病因中列第二位。2020年WHO全球癌症报告显示,中国肝癌发病人数占全球总数的45.27%,死亡人数占全球总数的47.12%,已成为严重威胁人民生命健康安全的重大疾病。肝癌的治疗首选是手术切除,但往往发现时已处于中晚期,失去手术机会。随着科技发展,众多新的治疗手段逐渐涌现,如经肝动脉栓塞化疗术、射频消融术、微波消融术、放射治疗、肝移植术及生物靶向治疗、免疫治疗等,结合患者肝癌分期系统、患者个人意愿及治疗的反应可制定个体化的治疗方案,但治疗效果都有一定的局限性,预后无明显改变。寻找肝癌新的靶点以提高早诊早治效果具有重要临床意义。ETS（E26 transformation-specific）超家族是最大的转录调控因子家族之一,从结构上分为11个亚家族。所有的ETS转录因子都有一个高度保守的由85个氨基酸组成的ETSDNA结合域（ETS结构域）,该ETS结构域通过与启动子的核心序列[5’-GGA（A/T）-3’]特异性结合进而调控下游基因转录。研究表明ETS转录因子参与了细胞增殖、分化、迁移、凋亡、血管发育、器官形成等众多生理过程,其蛋白表达异常与肿瘤的发生、进展密切相关,因此已被认为是预测肿瘤预后的重要指标。上皮特异性ETS（epithelium-specific ETS,ESE）是ETS超家族的一个亚家族。分为两个亚群:（1）ELF3,ELF5,ESE3（2）SPDEF。在许多癌症的发生、发展过程中,有着不同的作用。上皮组织特异性转录因子3（epithelium-specific ETS factor family member 3,ESE3）,也被称为E26转化特异性同源因子（ETS homologous factor,EHF）,是ESE亚家族的一员,可以直接参与上皮-间质转化（EMT）、干细胞样特性和恶性进展过程,ESE3表达主要定位在上皮细胞的细胞核中。ESE3在不同的肿瘤中作用不同,在前列腺癌、胰腺癌、食管癌、结肠癌中均发挥抑癌作用,在胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、乳腺癌中则发挥促癌作用。ESE3在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）研究中发现其在细胞内的定位发生改变,主要表达在细胞浆中,正常食管上皮细胞中ESE3主要表达在细胞核中,ESE3抑制ESCC细胞增殖,过表达ESE3可以恢复其细胞核表达,发挥抑癌作用。但是ESE3在肝癌中的表达定位及相关作用尚未阐明。本研究中（一）我们首先研究ESE3在肝癌组织中和癌旁组织中的表达定位及表达水平;分析肝癌组织中ESE3的表达水平与肝癌患者术后复发、生存相关性,探讨ESE3预测肝癌患者术后复发和生存的临床价值。（二）其次,在体外细胞试验中,过表达/敲减ESE3,验证ESE3对不同肝癌细胞系细胞增殖、凋亡、细胞周期的作用。（三）最后,在裸鼠体内实验中对体外实验中的主要结论进行验证。第一部分 ESE3在肝细胞癌中的异常表达与临床病理特征及预后的相关性分析研究目的1、检测ESE3在肝癌组织和癌旁组织中的表达定位和表达水平。2、阐明肝癌组织中ESE3的表达水平与肝癌患者临床分期、肿瘤直径、肿瘤数目、血管侵袭等临床病理特征的关系。3、探讨肝癌组织中ESE3的表达水平与患者复发及生存预后相关性。研究ESE3预测患者术后复发和生存的临床价值。研究方法1、收集未经任何抗肿瘤治疗患者的肝癌组织与癌旁肝组织标本,制做组织芯片,在新鲜组织和构建的组织芯片中,应用Western Blot和免疫组化,检测ESE3在肝癌组织和癌旁组织中表达;2、Image Pro软件分析计算免疫组织化学染色的累积光密度（IOD）值,以LogIOD值评价ESE3表达水平,以LogIOD值中位数为cutoff值分为高表达组和低表达组,分析ESE3表达水平与肝癌患者临床分期、肿瘤直径、侵袭等临床病理特征的关系;3、运用生存分析（Kaplan-Meier曲线、COX风险比例模型）和受试者工作特征分析（ROC曲线）等统计学方法,研究肝癌组织ESE3表达水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系,并依据患者病理学特征进行分层分析,评估肝癌组织中ESE3作为肝癌患者复发和生存独立预测指标的可能性和临床价值。结果一、ESE3在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况1、ESE3主要在肝癌组织和癌旁组织中的细胞浆中表达,细胞核中少见。2、肝癌组织中ESE3的表达水平明显低于癌旁组织;癌组织中ESE3低表达率显著高于癌旁组织。94例肝癌组织中,EdmondsonⅠ级的肝癌组织中ESE3表达水平明显高于EdmondsonⅡ级及Ⅲ级的肝癌组织。3、5例新鲜组织中,肝癌组织中的ESE3的蛋白表达水平显著低于癌旁组织。二、肝癌组织中ESE3的表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系肝癌组织中ESE3低表达与血管侵袭、多个肿瘤结节、BCLC分期（B+C）和较差的Edmondson分级存在呈正相关,而与患者的年龄、性别、病毒学特征、是否合并肝硬化和肿瘤直径之间均无明显的相关性。三、肝癌组织中ESE3表达水平及临床病理特征对肝癌术后患者预后的生存分析1、Kaplan-Meier（K-M）分析显示;肝癌组织ESE3高表达组患者的累积无复发率（RFS）和累积生存率（OS）均显著高于ESE3低表达组。2、单因素分析显示;肝癌组织中ESE3表达水平、肿瘤直径、血管侵袭、BCLC分期均是影响患者RFS和OS的显著因素;Edmondson分级也是影响患者RFS的显著因素。3、多因素分析结果显示:肝癌组织中ESE3表达水平和肿瘤直径是影响患者RFS和OS的独立危险因子;Edmondson分级也是影响患者RFS的独立危险因子。由此可见,肝癌组织中ESE3表达水平是肝癌术后患者RFS和OS的独立预测指标。四、肝癌组织中ESE3获得/保留以及ESE3丢失对肝癌术后患者预后的生存分析根据肝癌组织中ESE3表达水平与匹配癌旁组织中ESE3表达水平的关系,分为“ESE3丢失组”（ESE3 T＜N,n=27）和“ESE3获得/保留组”（ESE3 T≥N,n=24）。结果显示:“ESE3丢失组”的无复发时间（中位时间22个月）和总生存时间（中位时间37个月）较“ESE3获得/保留组”无复发时间（中位时间31个月）和总生存时间（中位时间47个月）均显著缩短;K-M生存分析显示上述两组患者的RFS和OS均有显著差异。五、依据患者不同病理学特征进行分层,肝癌组织中ESE3表达对患者预后预测的价值BCLC分期（0+A）、肿瘤＜5cm、无血管/包膜侵袭、单个肿瘤结节、Edmondson分级（Ⅰ+Ⅱ）的患者定义为肝癌“早期组”（Early-stage）;BCLC分期（B+C）、肿瘤≥5cm、有血管/包膜侵袭、多个肿瘤结节、EdmondsonⅢ级的患者为肝癌“晚期组”（Late-stage）。1、在肝癌“晚期组”的分层患者中,肝癌组织中ESE3的表达水平对RFS和OS的预测无显著意义。2、在肝癌“早期组”的分层患者中,ESE3表达水平对患者术后复发和生存都有较好的预测价值,是一个潜在的早期肝癌患者预后因子。小结1、ESE3主要表达在肝癌细胞和癌旁肝细胞的胞浆。2、肝癌组织中ESE3低表达与肝癌进展和不良预后有关,可作为肝癌术后判断患者复发和生存的预测指标,尤其是对于早期阶段的肝癌患者。第二部分ESE3在肝癌细胞中的表达及对肝癌细胞生物学功能的影响研究目的1、检测ESE3在肝细胞和不同肝癌细胞系中的表达定位和水平。2、研究ESE3表达对肝癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。3、在体内实验,验证ESE3过表达对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。研究方法1、Western Blot、qPCR和细胞免疫荧光染色研究ESE3在不同肝癌细胞系和正常肝细胞系LO2中的表达情况及细胞亚定位情况。2、构建ESE3慢病毒表达载体,Western Blot验证ESE3的过表达效果;构建三种ESE3-SiRNA,Western Blot验证ESE3 的敲减效率。3、过表达/敲减ESE3,MTT实验检测ESE3对肝癌细胞增殖的影响;流式细胞术验证ESE3对细胞凋亡影响。4、过表达/敲减ESE3,流式细胞术检测ESE3对肝癌细胞周期的影响。5、应用过表达的肝癌细胞HepG2,构建裸鼠皮下移植瘤模型,绘制皮下移植瘤的生长曲线,处死小鼠后,测量小鼠皮下移植瘤的体积和重量,验证ESE3对肝癌细胞的影响。研究结果一、ESE3在肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达1、ESE3在人正常肝细胞系LO2细胞中可见显著表达;而在其他三种肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Huh7中表达水平降低。ImageJ分析证实:在三种肝癌细胞系中ESE3蛋白的相对表达量均低于人正常肝细胞系LO2。2、三种肝癌细胞系中ESE3 mRNA的表达水平均低于正常肝细胞系LO2。3、ESE3主要定位在肝癌细胞Hep3B的细胞浆中。二、肝癌细胞系ESE3敲减和过表达实验依据研究结果（一）的结果,选择Hep3B细胞系作为ESE3敲减试验的候选细胞系;选择HepG2细胞系作为ESE3过表达试验的候选细胞系。1、设计三种ESE3-SiRNA（ESE3-SiRNA-1/2/3）,转染Hep3B肝癌细胞。与ESE3-SiNC对照组比较,ESE3-SiRNA-1以及ESE3-SiRNA-3组细胞中ESE3表达下调显著。选用效率更优的ESE3-SiRNA3进行后续细胞生物学功能研究。2、构建ESE3慢病毒表达载体（pLVXpuro-ESE3）,以空载体（pLVXpuro）作为对照。转染在HepG2肝癌细胞系中,Western Blot检测显示:过表达组HepG2细胞的ESE3的表达明显高于对照组。三、ESE3通过抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,发挥抑癌作用1、ESE3过表达抑制肝癌细胞的增殖。（1）72h、96h以及120h观察点,ESE3过表达组HepG2细胞增殖程度显著低于对照组。（2）24h和72h观察点,ESE3过表达组Hep3B细胞增殖程度显著低于对照组。2、ESE3敲减促进肝癌细胞的增殖72h观察点,ESE3敲减组Hep3B细胞增殖程度显著高于对照组。3、ESE3过表达促进肝癌细胞凋亡与对照组比较,ESE3过表达组Hep3B细胞和HepG2细胞的细胞凋亡率均显著升高。4、ESE3敲减抑制肝癌细胞凋亡（1）ESE3敲减组Hep3B细胞的细胞凋亡率明显低于对照组。（2）ESE3敲减组HepG2细胞的细胞凋亡率略低于对照组,但两者没有统计学差异。四、ESE3通过使肝癌细胞停滞于G0/G1期的比例增加,发挥抑癌作用1、ESE3过表达对肝癌细胞周期的影响与对照组相比,ESE3过表达组Hep3B细胞和HepG2细胞的G0/G1期细胞比例均升高、S期细胞比例均降低。2、ESE3敲减对肝癌细胞周期的影响（1）与对照组相比,ESE3敲减组Hep3B细胞的G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高。（2）与对照组相比,ESE3敲减组HepG2细胞的G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高,但两组没有统计学差异。五、体内试验验证ESE3抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤生长裸鼠皮下肝癌移植瘤瘤体生长曲线显示:ESE3过表达的HepG2细胞皮下成瘤生长速度显著降低;瘤体的体积和重量均显著下降。小结1、相比正常肝细胞,ESE3在肝癌细胞中的表达降低。ESE3主要定位在肝癌细胞浆中。2、ESE3可以通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、使肝癌细胞停滞于G0/G1期的比例增加,从而发挥抑癌作用,有潜力成为一个新的潜在治疗靶点。