近年来发现了几种广谱中和性抗体,能够识别HIV-1病毒包膜蛋白上相对保守的表位,在体外能有效的中和HIV-1病毒各亚型的多种单克隆抗体杂交瘤株,如b12、2F5、4E10、2G12、PG9和PG16,以及最近发现的VRC01、VRC02和VRC03等,这些广谱中和性单抗的发现为能设计出诱导中和性抗体产生的疫苗提供了有利的证据。对这些抗体分子进行深入研究,阐明抗体识别的病毒表位,为诱发保护性抗体反应的抗原表位设计提供了理论依据。本研究根据NCBI公布的广谱中和性抗体VRC01及b12的氨基酸序列,依据大肠杆菌密码子偏爱性,将氨基酸序列优化成DNA序列,设计相应的引物,以单抗VRC01和b12的重链和轻链基因为模板,分别扩增其可变区基因片段,后用重叠PCR的方法将二者拼接,形成scFv-VL-Linker-VH的结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体 pET28a-VRC01-scFv 和 pET28a-b12-scFv;转入大肠杆菌 BL21（DE3）,经 IPTG诱导,获得重组蛋白b12-scFv,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体。可溶性蛋白用Ni-NTA柱亲和纯化,纯化蛋白的产量约为2mg/L。用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术（FCM）检测纯化蛋白与HIV-1 gp120的结合活性,结果表明b12-scFv对分泌表达的gp120和细胞膜表面的gp120都具有良好的特异性结合活性,可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测;而重组蛋白VRC01-scFv以包涵体的形式存在,包涵体经尿素变性,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用50～500 mmol/L咪唑洗脱可从层析柱上解离下来,从而得到初步纯化的蛋白。用500 mmol/L咪唑洗脱的产物在PBS溶液中透析后从上清中检测到了复性的VRC01-scFv蛋白,但复性率不高,无法得到足够数量的蛋白做后续的活性检测,最佳的复性条件有待于进一步实验摸索。在构建的单链抗体原核表达载体pET28a-b12-scFv和pET28a-VRC01-scFv基础上,用酶切和插入的方法构建双特异性原核表达载体pET28a-b12-scFv-Linker-4E10-scFv及pET28a-VRC01-scFv-Linker-4E10-scFv。转入大肠杆菌 BL21（DE3）,经 IPTG 诱导,获得重组蛋白b12-scFv-4E10-scFv及VRC01-scFv-4E10-scFv,这两种蛋白均以包涵体的形式存在。包涵体经尿素变性,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用50～500 mmol/L咪唑洗脱可从层析柱上洗脱下来,从而得到初步纯化的蛋白,后将含有目的蛋白的洗脱组份合并后,用尿素浓度依次递减的方法透析复性,透析结束后离心分离上清沉淀,蛋白主要以沉淀的形式析出,得到数量极少的可溶性蛋白,限制了进一步的活性检测。表明目标蛋白可溶性太差,蛋白复性条件有待于进一步优化。本研究运用基因工程的方法在体外小量制备的单链抗体和双特异性抗体,可用于艾滋病的被动免疫防治;在疫苗的设计中,可用于抗体抗原表位的检测,为深入研究广谱中和性抗体与HIV抗原分子的相互作用,以及设计新型有效的HIV疫苗奠定了理论基础。