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目的:慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者普遍存在骨骼肌功能障碍（skeletal muscle dysfunction,SMD）,本课题分析慢阻肺患者发生骨骼肌功能障碍的影响因素,观察益气固表丸对肺脾气虚证慢阻肺合并骨骼肌功能障碍患者临床疗效,并分析益气固表丸有效成分、筛查异常表达的微小核糖核酸（Micro RNA,miRNA）及其对靶基因及蛋白的调控机制,阐述益气固表丸通过调控Mi RNA改善慢阻肺患者肺脾气虚状态作用的分子机制,为中西医结合辩证治疗慢阻肺提供临床及实验室研究基础。方法:根据2017慢性阻塞性肺疾病全球倡议（The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD）分级标准,选择中医证属肺脾气虚证候的COPD稳定期患者,记录并分析:主观症状包括:COPD生活质量评分（COPD Assessment test,CAT）、中医症候量表及呼吸困难评分量表（modified British medical research counci,m MRC）;客观指标包括:肺功能测定、去脂肪指数（fat-free mass index,FFMI）、双手握力（hand grip strength,HGS）及6分钟步行距离（Sixminutes walk distance,6mwd）,采用ELISA方法检测患者外周血肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK）水平的差异性,分析影响COPD患者出现SMD可能的相关因素;在此基础上,按照随机双盲对照（Randomized double-blind control,RCT）原则,使用益气固表丸或安慰剂,用药12周,每4周随访一次,共随访3次,比较2组患者用药后上述指标的变化及外周血淋巴细胞Th17/Treg平衡的变化情况,利用TCMSP、BATMAN-TCM、Target Scan、String、PITA及micro RNA org等公共数据库对益气固表丸有效成分及靶蛋白,miRNA的靶基因进行筛查,取共同的基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析筛选可能作用的疾病、靶基因及通路,采用q RT-PCR方法验证益气固表丸用药前后差异表达的miRNA;最后,通过人萎缩骨骼肌原代细胞培养成为萎缩肌管细胞（Human atrophy skeletal muscle myotube cell Hahsmmc）模型,使用倒置电子显微镜观察不同浓度及时期细胞形态,采用ELISA方法检测细胞沉淀肌酸激酶（Creatine kinase CK）水平,沉默筛查出差异表达的miRNA,使用流式细胞仪检测转染后细胞增殖情况,RT-PCR及Western-blot验证差异表达的目标通路中标志蛋白m RNA及磷酸化的变化。结果:根据其合并症将COPD稳定期患者（n=164）,分为合并SMD组（n=80）及未合并SMD组（n=84）,以及同期就诊的同龄对照者（n=41）,选择合并SMD组者（n=80）揭盲后分为益气固表丸组（n=37）及对照组（n=33）,总脱落率为12.5%,共完成70例。一般情况比较:合并SMD组、未合并SMD组及同龄对照组患者年龄无统计学差异（P＞0.05）,合并SMD组患者较未合并SMD组及同龄对照组患者体重偏轻（P＜0.05）。给予益气固表丸12w后,益气固表丸组及对照组患者在年龄、体重、身高基线资料比较无差别（P＞0.05）,在性别分布中,存在分布差异,益气固表丸组中男性患者较多（P＜0.05）。病情及主观症状比较:合并SMD组及未合并SMD组COPD患者急性加重次数/年、CAT和6mwd无明显统计学差异（P＞0.05）,合并SMD组COPD患者病程较短,住院次数/年较未合并SMD组COPD患者次数增多,肺脾气虚相关中医证候较明显（P＜0.05）,同时提示合并SMD组COPD患者行动能力下降。益气固表丸组患者治疗后中医症候评分和CAT评分均有减少（P＜0.05）,治疗后m MRC分级,2级以上比例减少,1级及以下COPD患者比较增加（P＜0.05）,6WMD未见明显变化（P＞0.05）。益气固表丸组及对照组患者治疗后中医症候评分、CAT评分及m MRC分级的比较分析发现,益气固表丸组COPD患者的中医症候评分降低（P＜0.05）,其余指标变化不大（P＞0.05）。FFMI及HGS比较:COPD患者HGS普遍下降,合并SMD的COPD患者双手肌力均下降尤为明显（P＜0.05）,与性别无关。益气固表丸组患者治疗前后FFMI、SM指标无变化,但手握力指标HGS有增加（P＜0.05）。治疗后益气固表丸组患者FFMI、SM和HSG指标均高于对照组患者（P＜0.05）。肺功能指标比较:合并SMD组患者较未合并SMD组患者肺功能指标:FEV1、FVC及PEF均降低（P＜0.05）。治疗后益气固表丸组患者FEV1/FVC%和FEV1%指标上升（P＜0.05）,益气固表丸组患者治疗后较对照组患者肺功能指标FEV1/FVC%升高（P＜0.05）。TWEAK水平比较:合并SMD组患者外周血TWEAK偏高（P＜0.05）,益气固表丸组患者治疗后TWEAK下降（P＜0.05）,对照组患者治疗后TWEAK指标变化不明显（P＞0.05）。Th17/Treg比较:益气固表丸组患者用药后Th17%降低,Treg%升高,Th17/Treg水平下降,有统计学意义（P＜0.05）,对照组患者用药后Th17%、Treg%和Th17/Treg水平均无明显变化,无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析发现FEV1/FVC%、FVC%及FEV1%与SM呈正相关（P＜0.05）,FVC及PEF与SM呈显著正相关（P＜0.01）,FVC及PEF与FFMI呈显著正相关（P＜0.01）;多因素Logistics回归建模分析发现,年龄、住院次数/年、PEF、心血管病合并症及HGS均为COPD患者出现SMD的影响因素（P＜0.05）。利用TCMSP数据库筛查获得益气固表丸1360种化学成分,其中符合OB≥30%及DL≥0.18条件的有效成分共192个,去除重复有效成分共128个,将有效成分进行靶点-基因名转换,获得644个靶蛋白,17个作用靶点群。根据644个靶蛋白,在BATMAN-TCM数据库中进行富集分析,GO分析共获得371个生物过程（BP,biological process）、42个细胞组分（CC,cellular component）、78个分子功能（MF,molecular function）;KEGG分析发现显著富集的通路有37条,发现与炎症相关的通路有PI3K-Akt信号通路及P53信号通路,益气固表丸可能治疗185种疾病,包括10种肺部相关疾病,其中肺系疾病（lung disease）、非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma）,FDR＜0.05,有统计学意义。以“COPD”和“miRNA”为关键词,筛选pubmed数据库中与外周血相关的miRNA,通过对127篇文献分析,总结差异表达的miRNA59个,将miRNA-m RNA转换,获得18436个靶基因,对以上m RNA进行富集分析,GO分析共获得9113条生物过程、1294条细胞组分、203条分子功能;KEGG分析发现显著富集的通路有24条,m NRA与肿瘤、病毒感染及能量代谢相关等通路相互作用,包括PI3K/Akt/m TOR等信号通路。筛选靶基因中参与KEGG分析中所得显著富集通路中与骨骼肌功能障碍有关的miRNA,得到5个miRNA:miR-1-3p、miR-422a、miR-206、miR-145-5p及miR-133b。采用q RT-PCR方法对用药前后外周血血清（n=30）进行验证,发现用药前miR-422a偏低（P＜0.05）,用药后未见明显变化（P＞0.05）,miR-145-5p及miR-133b用药前均降低（P＜0.05）,用药后升高（P＜0.05）,并根据差异表达的hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133b及hsa-miR-422a筛选位于PI3K/AKT/m TOR通路的靶基因列表,与网络互作图中位于中心节点的25个m RNA比较后发现,多数m RNA均集中于PI3K/Akt/m TOR信号通路,结合益气固表丸有效成分靶蛋白富集分析结果,选择PI3K/Akt/m TOR通路于细胞层面进一步验证。取慢阻肺合并SMD患者肋间肌肌肉组织提取原代细胞,于倒置显微镜下观察不同时期萎缩肌细胞形态发现,初始细胞形态呈幼圆形,形态均一,折光性强,细胞核细小,细胞逐渐延伸成梭形,相互融合,排列有序,细胞生长较迅速,2%马血清DMEM-H培养基进行分化后形成肌管细胞,其形态呈现聚集状态,细胞核较前增大,形态增粗,细胞对数增长速度较前缓慢,使用质粒载体（vigofect）转染后不同时期（24h、48h）观察镜下萎缩肌管细胞形态,可见上浮少量的（高光）死亡细胞,肌丝萎缩断裂,形态较转染前明显缩小变形。采用vigofect方法,沉默si-miR145-5p及si-miR-133b转染人萎缩的骨骼肌肌管细胞,采用流式检测发现NC组细胞S期细胞减少,分析细胞总数下降（P＜0.05）,si-miR145-5p组细胞S期细胞升高,细胞个数升高（P＜0.05）,si-miR-133b组细胞S期细胞升高,系数升高,细胞个数增加（P＜0.05）,采用WB方法检测发现,与WT组相比,si-miR145-5p组及si-miR-133b组p-m TOR、p-PI3K及p-Akt蛋白磷酸化水平下降（P＜0.05）;与NC组相比,p-m TOR、p-PI3K及P-Akt蛋白磷酸化水平下降（P＜0.05）,RT-q PCR方法检测发现,与WT组相比,si-miR145-5p组及si-miR-133b组PI3K、AKT及m TOR m RNA表达下降（P＜0.05）。与NC组比较,si-miR145-5p组及si-miR133组PI3K、AKT及m TOR m RNA表达下降（P＜0.05）。结论:本课题以“培土生金”治则为核心,探讨影响COPD患者骨骼肌功能障碍影响因素,观察益气固表丸治疗COPD合并SMD临床疗效,明确其健脾益气作用的微观作用机制,研究发现:1)FFMI结合HGS能够有效评估慢阻肺患者骨骼肌功能状态,慢阻肺合并骨骼肌功能障碍患者肺脾气虚证候明显,年龄、住院次数/年、PEF水平、心血管病合并症及HGS等因素均为影响慢阻肺患者骨骼肌功能状态的因素。2)益气固表丸能够改善慢阻肺患者肺脾气虚相关症状,提高运动耐力,保持FFMI及HGS水平,减缓肺功能下降,降低患者外周血中慢性炎性状态,对慢阻肺稳定期患者外周血中T细胞亚群具有良性调节作用。3)益气固表丸有效成分以异黄烷酮、土木香、松脂醇二-B-D葡萄糖苷、款冬酮、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为主,治疗靶点可能为鸟苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1、跨膜丝氨酸蛋白酶、过氧化物酶体增殖物激活受体、微管相关蛋白1A、胰岛素样生长因子-1等产生作用,并通过影响蛋白水解等生物学过程,影响细胞质等细胞成分及影响丝氨酸型内肽酶活性对肿瘤相关通路产生作用,可以治疗非小细胞肺癌、男性生殖系统肿瘤、前列腺癌等疾病,可能通过PI3K/Akt信号通路及（或）P53信号通路对呼吸系统疾病产生作用。4)慢阻肺合并骨骼肌功能障碍患者外周血中miR-422a、miR-145-5p及miR-133b表达明显降低。益气固表丸能够使miR-145-5p及miR-133b表达升高,并通过调控miR-145-5p及miR-133b对PI3K/Akt/mTOR通路起到抑制作用。