论文部分内容阅读
目的:梨状皮层（piriform cortex,PC）是嗅觉环路中的重要核团,参与气味的分析与传递,能调节惊恐情绪、学习与记忆、调控癫痫发作,调节睡眠的功能。PC在结构上分为前梨状皮层（anterior piriform cortex,APC）和后梨状皮层（posterior piriform cortex,PPC）,PC神经元由大量谷氨酸能神经元（Glutamatergic neuron）和少量GABA（gamma-aminobutyric acid）能神经元构成。本实验室前期研究中发现在吸入麻醉药异氟烷作用下PC处有大量c-Fos蛋白表达,表示异氟烷麻醉后PC神经元被激活。但PC是否参与全身麻醉的过程及其作用机制目前尚不清楚。为明确PC是否参与全身麻醉过程,本实验研究逆通过:1.c-Fos染色,分别在异氟烷、丙泊酚麻醉后灌注切脑,行c-Fos、Neu N染色;2.通过化学药物毁损APC、PPC神经元,观察实验鼠在异氟烷、丙泊酚麻醉时的行为学变化;3.化学遗传学调控APC神经元,记录实验鼠在异氟烷、丙泊酚麻醉时的行为学及皮层脑电（Electro-encephalography,EEG）变化情况;4.化学遗传激活PCGlu神经元,记录实验鼠在异氟烷、七氟烷、丙泊酚麻醉下的行为学及EEG、EMG（Electromyogram）变化情况;5.光遗传激活APCGlu神经元,记录实验鼠在异氟烷、七氟烷、丙泊酚麻醉下的行为学及EEG、EMG变化情况;6.探索APC上游、下游核团。目的在于探索PC在全身麻醉中的作用机制。方法:1.c-Fos染色:将实验鼠在清醒状态下,异氟烷、丙泊酚作用于实验鼠待LORR后持续给药2 h,异氟烷、丙泊酚作用实验鼠2 h后苏醒2 h三种条件下心脏灌注取脑,切片染色,观察PC神经元c-Fos及Neu N表达情况。并计算c-Fos数量,明确异氟烷/丙泊酚诱导的麻醉对谷氨酸能神经元活性的影响。2.使用化学药物毁损PC神经元,观察记录实验鼠在异氟烷、丙泊酚麻醉下翻正反射消失时间（Loss of righting reflex,LORR）、恢复时间（Recovery of righting reflex,RORR）。3.采用化学遗传学激活PC神经元,观察实验鼠在异氟烷、丙泊酚麻醉下LORR、RORR及EEG变化。4.化学遗传学激活APCGlu神经元,观察实验鼠在异氟烷、七氟烷、丙泊酚麻醉下LORR、RORR及EEG、EMG改变。5.光遗传学激活APCGlu神经元,观察实验鼠在异氟烷、七氟烷、丙泊酚麻醉下LORR、RORR及EEG、EMG改变。6.在APC处分别注射CTB、AAV-h Syn-Ch R2-EYFP病毒探索PC上游、下游核团。结果:1.异氟烷、丙泊酚持续给药2 h后PC处c-Fos大量激活,持续给药2 h后苏醒2 h PC处c-Fos又减少;并且被激活c-Fos与Neu N表达共定位。2.将实验鼠APC处神经元毁损后,将实验鼠持续吸入异氟烷后测得LORR明显缩短（p＜0.01）,而RORR无明显改变;实验鼠尾静脉单次注射丙泊酚测得RORR无明显变化;PPC毁损后异氟烷、丙泊酚作用于实验鼠行为学无明显变化。3.激活APC神经元,异氟烷麻醉LORR明显缩短（p＜0.01）,相应皮层δ波（1-4Hz）减弱（p＜0.05）,β波（12-25Hz）增强（p＜0.05）,异氟烷麻醉RORR无明显变化,对应EEG无明显改变;丙泊酚麻醉RORR无明显改变,对应EEG无明显差异。4.长时间激活APCGlu神经元,异氟烷麻醉LORR明显延长（p＜0.05）,对应EEGδ波功率降低（p＜0.05）,而RORR无改变;七氟烷麻醉LORR明显延长（p＜0.001）,对应EEGδ波功率增加,伽马波功率减少（p＜0.05）;丙泊酚麻醉LORR、RORR均无明显变化,对应EEG无明显改变。5.即时激活APCGlu神经元,异氟烷麻醉LORR明显延长（p＜0.05）,而RORR无改变,对应EEG无明显差异;七氟烷麻醉LORR明显延长（p＜0.05）,而RORR无改变,对应EEG无明显差异;丙泊酚麻醉LORR、RORR均无明显变化,对应EEG无明显改变。6.示踪结果:APC注射CTB后,在丘脑前背核（anterodorsal thalamic nucleus,AD）、前连合床核（bed nucleus of the commissure,BAC）观察到投射;在PC注射AAV-h Syn-Ch R2-EYFP,在边缘下皮层（infralimbic cortex,IL）观察到投射。结论:1.异氟烷、丙泊酚激活PC神经元,且异氟烷激活PCGu神经元,提示PC参与异氟烷、丙泊酚麻醉过程;2.APC神经元参与调控异氟烷麻醉诱导,其中激活APCGlu神经元延长异氟烷、七氟烷麻醉诱导时间,提示APCGlu神经元调控异氟烷、七氟烷麻醉诱导;3.初步发现PC上游核团AD、BAC,下游核团IL。