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一、背景及目的结肠癌在全球范围及我国男女性中发病率及死亡率均位居前列,虽然目前发病群体仍以50岁以上中老年人群为主,但近年来在青年人群中发病率稳步上升,且中晚期患者比例更高。近年来随着高龄人群筛查增多,结肠镜技术进展,外科手术技术进步,MDT逐渐普及,多种靶向药物面世,结肠癌患者的预后有所改善,但仍缺乏敏感性特异性俱佳的生物标志物,继续探索结肠癌发生、进展、转移过程中的分子机制,以期找到更敏感的早期诊断及预后预测标志物和更有效的治疗靶点。近十余年来G蛋白信号调节（RGS）蛋白家族逐渐成为肿瘤研究中的热点,目前RGS16在乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌等疾病的发生发展中的作用机制已有较多报道,但在结肠癌中的作用研究极少,其具体分子机制尚未见报道。二、研究方法1.基于生物信息学方法于TCGA数据库筛选出结肠癌相关基因RGS16,分析RGS16的表达水平,与不同结肠癌病理分型、疾病分期、不同肿瘤转移的程度的相关性,并进行预后分析。2.纳入山东省立医院63例接受结肠癌切除术患者的配对癌及癌旁组织,应用免疫组织化学染色法验证RGS16的表达情况。其中30例患者应用实时定量PCR及Western blot检测结肠癌组织和配对正常肠粘膜组织中RGS16的表达水平。3.体外实验研究RGS16对结肠癌细胞生物学功能的影响:通过细胞增殖实验（MTT）、细胞克隆形成实验、EdU实验,分析RGS16敲降和过表达对结肠癌细胞增殖的影响;通过细胞周期检测,分析RGS16敲降和过表达对结肠癌细胞周期的影响。通过凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色）,分析RGS16敲降和过表达对结肠癌细胞凋亡的影响,应用Western blot方法检测敲降和过表达RGS16后的结肠癌细胞中凋亡相关蛋白PARP、Bax和Bcl-2的表达水平;通过Transwell迁移实验、划痕实验分析RGS16敲降和过表达对结肠癌细胞迁移能力的影响,并应用Western blot方法检测敲降和过表达RGS16后的结肠癌细胞中迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。4.动物体内实验验证RGS16表达对结肠癌增殖凋亡的影响:通过慢病毒sh-RGS16转染稳定敲降结肠癌细胞株HT-29中RGS16的表达,构建裸鼠皮下瘤移植增殖模型,测量敲降组及对照组皮下瘤体积、重量并绘制生长曲线,组织切片免疫组化染色Ki67以及进行Tunnel实验确定细胞凋亡率。5.应用二代测序技术及生物信息学方法推测RGS16可以调控的下游信号通路,并应用qRT-PCR、Western blot方法来检测目标通路中相关蛋白在RGS16敲降及过表达细胞株中的表达水平,然后通过挽救实验来证实,上调目标信号通路的关键蛋白VEGFR2是否可以逆转RGS16敲降后造成的结肠癌细胞生物学功能变化,包括CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell迁移实验、EdU实验。在两组裸鼠皮下瘤组织切片中免疫组化染色目标通路关键蛋白的表达水平进一步验证上述结论。三、结果1.生信分析及临床标本研究RGS16在结肠癌组织中的表达及临床意义:（1）生信分析结果显示RGS16在结肠癌组织中表达水平显著上调,且表达水平随疾病分期、肿瘤转移程度的升高而增高。（2）实时定量PCR和Western Blot检测示RGS16表达水平在结肠癌组织中较癌旁正常组织显著上调（p＜0.05）。（3）免疫组织化学染色示:结肠癌组织中RGS16表达水平与癌旁组织相比明显升高。卡方检验分析RGS16表达与患者临床病理特征之间的关系示:RGS16表达水平与结肠癌TNM分期及淋巴结远处转移显著相关（p＜0.05）,与患者年龄、性别、分布位置、病理分化程度无显著相关（p＞0.05）。2.体外实验验证RGS16对结肠癌细胞生物学功能的影响:（1）构建高/低表达RGS16的三个结肠癌细胞系,Western Blot结果示HT29、SW480细胞株中RGS16蛋白表达水平显著降低（p＜0.01）,而HCT116细胞株中RGS16蛋白表达水平显著升高（p＜0.01）提示构建成果。（2）MTT实验、平板克隆形成实验及EdU实验结果示:RGS16表达水平上调对结肠癌细胞增殖有明显促进作用,而RGS16表达下调则可抑制结肠癌细胞增殖,组间差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001,p＜0.0001）。（3）细胞周期检测结果示:下调RGS16的HT29和SW480两个细胞系中,G0/G1期细胞比例增多,而S期细胞比例显著减少,差异具有统计学意义上调RGS16表达的HCT116细胞系中,处于G0/G1期、G2/M期的细胞比例显著减少,而S期细胞比例显著增多,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001,p＜0.0001）。（4）凋亡实验结果示:在敲降RGS16的HT29和SW480结肠癌细胞系中细胞凋亡率显著增加,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001,p＜0.0001）;相反在RGS16过表达的HCT116细胞系中,细胞凋亡率显著下降,差异具有统计学意义（p＜0.05）。Western blot测凋亡相关蛋白示,RGS16表达下调后Bax和PARP表达水平显著升高（p＜0.001）,而Bcl-2的表达水平显著下降（p＜0.001）;RGS16表达上调后Bax和PARP蛋白的表达水平显著下降（p＜0.001）,而Bcl-2表达水平显著升高（p＜0.001）。（5）Transwell迁移实验结果示:RGS16表达下调后结肠癌细胞的迁移能力显著降低,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001）,而过表达RGS16后细胞迁移能力显著增强,差异具有统计学意义（p＜0.05）。划痕实验示:敲降RGS16后细胞迁移率显著降低,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001）,而过表达RGS16后细胞的迁移率显著升高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。Western Blot检测迁移相关蛋白示:在HT29和SW480细胞系中敲降RGS16后,E-cadherin蛋白表达水平显著升高,而N-cadherin和Vimentin表达水平降低,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01）。在过表达RGS16的HCT116细胞系中,E-cadherin蛋白表达水平显著降低,而N-cadherin和Vimentin升高,差异具有统计学意义（p＜0.01）,提示RGS16可促进下调E-cadherin的表达水平,上调N-cadherin、Vimentin的表达水平,从而促进结肠癌的侵袭迁移。3.体内动物实验验证RGS16对结肠癌细胞增殖凋亡的影响,裸鼠皮下瘤移植增殖模型实验示:（1）RGS16敲降后裸鼠皮下肿瘤生长变慢,体积肿瘤均明显减小,差别具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01）。（2）裸鼠皮下瘤组织切片Ki-67染色:RGS16敲降组染色细胞阳性比例显著低于对照组,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（3）Tunnel实验示:RGS16敲降组细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。4.RGS16通过调控VEGFR2-PLCG2-PIK3CA-SPHK1-MAP2K1-ERK1 信号通路促进结肠癌增殖和迁移的机制研究（1）通过二代测序及生信分析推测RGS16可能通过VEGFR2-PLCG2-PIK3CA-SPHK1-MAP2K1-ERK1/2信号通路调控结肠癌发生发展。（2）在HT29和SW480两个细胞系稳定敲降RGS16后,应用qRT-PCR、Western Blot方法检测该信号通路中的六个关键因子VEGFR2、PLCG2、PIK3CA、SPHK1、MAP2K1、ERK1的转录水平和表达水平,结果示均不同程度下调,差异具有统计学意义（p＜0.05,p＜0.01）。在裸鼠皮下瘤组织中验证RGS16抑制后VEGFR2相关信号通路的四个关键蛋白VEGFR2、PLCG2、PIK3CA、SPHK1表达水平的变化,敲降组明显降低。（3）挽救实验:在两个敲降细胞株中上调VEGFR2表达水平,并进行CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell迁移实验、EdU实验,结果示:si-RGS16敲降组细胞增殖及迁移能力较对照组显著下降,而上调目标信号通路的关键蛋白VEGFR2后,可有效逆转敲降RGS16导致的结肠癌细胞增殖能力和迁移能力下降,达到预期挽救效果。四、结论1.RGS16在结肠癌组织中高表达,并与临床病理特征及不良预后相关。2.体外实验证明RGS16表达下调可抑制结肠癌细胞增殖、迁移,促进凋亡,诱导细胞周期阻滞。RGS16表达上调可促进结肠癌细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡。3.动物实验证明下调RGS16表达水平可在体内抑制结肠癌细胞增殖,诱导凋亡。4.RGS16可通过VEGFR2-PLCG2-PIK3CA-SPHK1-MAP2K1-ERK1 信号通路促进结肠癌增殖和迁移。5.RGS16可能成为结肠癌新的诊断及预后标志物和分子靶向治疗靶点。