第一部分:慢性中耳炎听力恢复的临床预测模型的构建及验证研究背景:中耳炎是我们国家的常见病和多发病,对听力的损害很大,影响人们的生活质量和健康,耳科学者们对中耳炎以及听力学的研究从未中断。在美国,听力损伤是第三大慢性疾病,仅次于高血压和关节炎[1]。《中国听力健康报告（2021）》蓝皮书[2]指出,中耳炎导致的听力残疾在我国听力残疾致残原因中所占构成比为11.80%。由此可见,我们须高度重视中耳炎导致的听力问题。依据我国中耳炎临床分类和手术分型指南（2012版）,中耳炎可分为分泌性中耳炎、化脓性中耳炎、中耳胆脂瘤和特殊类型中耳炎四大类,化脓性中耳炎又可分为急性化脓性中耳炎和慢性化脓性中耳炎[3]。中耳炎,尤其是慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤,往往造成患者耳流脓、听力下降,若处理不及时或处理不恰当,还会引起面神经麻痹、脑脓肿等颅内外并发症。需要手术治疗的中耳炎患者占较大部分,尤其是中耳胆脂瘤与慢性化脓性中耳炎是常见的需手术治疗的中耳炎类型,这些患者往往就医愿望迫切,对于手术后听力恢复的期望值较高,但目前尚无任何相关策略和模型来预测患者术后听力的恢复情况,无法对患者的听力恢复预期进行有效的预判,给患者带来困扰。对耳科医生来说,对患者的手术后听力可能恢复情况做出预测,以便有效解答患者的咨询,指导临床决策,将更利于临床工作和研究的开展。目前研究显示影响听力恢复的因素较多,根据文献报道和我们临床实践中的经验所知,患者的年龄、是否合并鼻炎情况、听骨链是否完整、是否植入人工听骨情况、咽鼓管功能情况、是否湿耳、听骨链周围是否有钙化或肉芽、手术方式等多种因素均可对术后听力产生影响。当前有很多研究已证明某个因素与听力恢复有关系,但是对多个因素与听力恢复预后关系的回归分析研究相对较少,对术后听力恢复做出预测模型的研究则更少见。因此,需要一种方法来对这些影响因素做出评估,进而对听力的预后情况做出适当判断,对临床有重要的指导意义和应用价值。临床研究越来越受到重视,临床医师有大量的临床资料,对这些资料进行综合、归纳和统计,可取得较好的研究成果,这对试验设计、统计学等的要求往往较高。随着个体化治疗和精准医学的发展,以及大数据时代的到来,使得我们对患者疾病的治疗越来越精细化。临床预测模型是一个评估风险和获益的量化工具,在日常的医学研究以及实践中应用越来越普遍。临床预测模型又称风险评估模型,包括诊断模型和预后模型。借助临床预测模型,研究者可以更精准的筛选出较为合适的研究对象,患者和医生可更好地做出一些有益的医疗决策,而卫生管理者以及政府部门也可以更好地进行医疗质量管理,合理的配置医疗资源。而基于R语言,构建列线图预测模型的方法越来越得到广大研究者的深度认可,近些年取得了极大进展。临床预测模型在耳鼻咽喉科中的实践应用也越来越受到重视,包括对下咽癌的生存预测模型的建立,对上颌窦癌预后模型的建立等等。参照2012版指南中的慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤的诊断标准,我们通过回顾性的队列研究对数据进行统计分析,建立了慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤手术后听力恢复的临床预测模型。目的:探讨影响慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤患者术后听力恢复的因素,建立听力恢复的临床预测模型,并验证模型的准确性。为患者提供听力恢复的个性化风险评估,以加强术前咨询并帮助患者设定切合实际的期望。为医生提供术前听力预测,对术中可能的高风险因素做好应对。为评估术后听力提供一个新的思路。方法:回顾性分析我院2012年1月1日至2020年9月30日的临床数据库中慢性化脓性中耳炎和中耳胆脂瘤的患者资料。收集患者的术前及术后6个月时纯音测听结果、基本资料、病史、手术方式、听骨链的完整性、植入的人工听骨假体的类型、听骨链周围是否有钙化和肉芽组织、咽鼓管是否有功能障碍、是否同期行咽鼓管球囊扩张术、是否混合性耳聋,术前干耳或湿耳,迷路瘘管,二次手术,是否合并糖尿病,鼻-鼻窦炎等。将患者分为训练组和验证组,使用单因素和多因素Logistic回归分析调查患者听力损失恢复的相关性。以500Hz、1000Hz、2 000Hz和4 000 Hz的纯音测听平均数计算,术后平均气骨导差（ABG）≤ 20 dB视为听力恢复有效。使用独立预后因素建立列线图（nomogram）来预测中耳炎的术后听力恢复情况。该模型经过了内部验证,并在鉴别、校准和临床有效性方面评估其性能。所有统计学分析使用基于R语言的EmpowerStats软件进行,P＜0.05视为差异有统计学意义。结果:本研究最终纳入了 2146名慢性化脓性中耳炎和中耳胆脂瘤患者;训练组包括1610名患者（男性733名[45.5%]）,验证组包括536名患者（男性234名[43.7%]）。多因素logistic回归分析显示年龄、病程时长、手术方式、听骨假体的植入、听骨链周围肉芽或钙化块、听骨链的完整性、咽鼓管功能障碍、混合性听力损失、迷路瘘管、二次手术与听力恢复有关。通过单因素和多因素回归分析,构建了基于这些变量的列线图,用以预测慢性化脓性中耳炎及中耳胆脂瘤的听力有效恢复概率。ROC曲线下面积在建模组中为0.797（95%CI,0.778-0.812）,在验证组中为0.798（95%CI,0.7605-0.8355）。训练组建立的列线图预测值与观测值之间的校正Bootstrap校正的 c指数为0.802（95%CI,0.781-0.824）。结论:1)该队列研究发现,年龄、手术方式、听骨假体植入物、听骨链周围的肉芽或钙化斑块、咽鼓管功能障碍、听骨链完整性、咽鼓管球囊扩张术、混合性听力损失、迷路瘘管和二次手术与听力有效恢复有关。2)我们经过验证的列线图结合了不同的临床数据,可以提供个性化的听力恢复风险评估,以加强术前咨询,帮助为患者设定切合实际的期望。3)该预测模型可用于评估临床听力恢复情况,利于评估可能的高风险因素,为中耳炎术后听力恢复的预后提供了新的研究思路。4)未来具有更多变量的多中心研究将有助于改进我们的模型,提供精度及可靠度更高的预测。第二部分:骨膜蛋白在中耳胆脂瘤的表达及意义研究背景:通过我们第一部分的研究可以看出,中耳炎患者,尤其在中耳胆脂瘤患者中发生听骨链破坏进而影响听力恢复。听骨链的完整性在中耳炎术后听力的恢复中占较大比重,为了进一步提高第一部分中耳炎听力恢复的预测模型的准确性,我们进一步进行了研究。寻找中耳胆脂瘤中能够密切影响听骨链完整性的组织学因素、进一步明确哪些因素与中耳胆脂瘤的听骨链受损关系密切,进而为该预测模型在组织学方面提供更多更好地预测因子。在中耳的炎性疾病中,中耳胆脂瘤的研究备受关注,其特征表现为中耳腔内存在高度增殖的角化鳞状上皮以及其对邻近周围骨质的破坏。中耳胆脂瘤对患者的听小骨及周围骨质往往会产生不同程度地破坏,且通常都需要外科干预。目前,对于中耳胆脂瘤的发病机制存在四种学说,包括①内陷袋学说;②上皮移行学说;③基底细胞层过度增生学说,④化生理论,其具体发病机制尚无定论。2016年欧洲耳科和神经病学学会（EAONO）和日本耳科学会（JOS）也对中耳胆脂瘤进行了定义、分类以及分期[4],并且发表了联合共识声明,该定义提出胆脂瘤是由上皮下结缔组织中的角质化鳞状上皮和角质碎片堆积在鼓室和（或）乳突形成团块,伴或不伴有周围炎症反应。并指出胆脂瘤上皮下结缔组织的反复感染和炎症反应使得邻近区域的骨吸收,又按照胆脂瘤发生的不同部位进行了分期（STAM system）。但尽管如此,目前,胆脂瘤的病理生理学过程和发病机制仍不甚明确。目前对胆脂瘤的研究主要集中在上皮细胞增殖与凋亡的分子生物学水平这两个方面。中耳炎是一种多种细胞因子释放的高度活跃的炎症过程,中耳胆脂瘤的骨破坏由炎症等进行激活和调节,其中,破骨细胞会降解骨质,但同时也会受到细胞因子、生长因子、黏附分子和促骨激素的保护性调控。胆脂瘤和肉芽组织中存在的肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-1、IL-6和OPG/RANKL促进骨溶解,增加对中耳的破坏作用,且中耳胆脂瘤患者中听骨链受损的发生率较慢性化脓性中耳炎的发生率更高[5]。MustafaA等的研究也发现中耳胆脂瘤患者比中耳炎不伴胆脂瘤的患者的听骨链破坏率更高,最常破坏的听骨成分是砧骨,其次是镫骨和锤骨[6]。骨膜蛋白（periostin）,又被称为POSTN,是一种细胞外基质蛋白,分子质量约为90kDa,目前发现其在人体的多种器官组织中表达,参与不同疾病的发生机制和病理过程。在骨关节炎、骨代谢、糖尿病肾病、哮喘、皮肤修复、组织纤维化、肌腱重塑、多种肿瘤疾病、鼻炎等疾病中,骨膜蛋白均参与其中的病理过程并具有一定的调控作用。在耳鼻喉科疾病中,骨膜蛋白也已经有所研究。Nobuo[7]等人研究发现,其广泛存在于慢性炎性疾病中,在支气管哮喘、特应性皮炎、心肌梗死后的心肌修复和重塑、嗜酸性食管炎、增殖性糖尿病视网膜病变、骨髓纤维化重塑中发挥重要作用。骨膜蛋白在变应性鼻炎、慢性鼻窦炎合并鼻息肉、嗜酸粒细胞性中耳炎的疾病变化过程中均有参与。在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者的鼻黏膜中发现,骨膜蛋白可能是一种重要的介质[8],参与Th2辅助T淋巴细胞介导的炎症、细胞外基质重构、纤维化、肿瘤血管生成和组织重塑等的病理过程。Hisanori[9]等研究者发现,在所有伴或不伴有哮喘的嗜酸粒细胞性中耳炎患者中的中耳免疫组化切片的基底膜和细胞外基质中发现了骨膜蛋白的阳性表达。胆脂瘤因为也具有包括异常的增殖、迁移和侵袭、可破坏骨质（尤其对听骨链的破坏影响较为严重）等很多类似肿瘤的特征,有时也会出现异常的骨质增生。因此我们推测骨膜蛋白在中耳胆脂瘤中可能会有表达。目前对中耳胆脂瘤组织中骨膜蛋白的表达情况研究尚未见报道,那么骨膜蛋白有没有可能成为我们寻找的中耳胆脂瘤术后听力恢复在组织学方面的预测因素呢,我们对其在中耳胆脂瘤中的表达情况做了进一步的研究。目的:研究骨膜蛋白在外耳道皮肤、不同听骨链破坏程度中的胆脂瘤上皮成分中的表达情况,探讨其意义,为中耳胆脂瘤术后听力恢复的预测模型在组织学方面寻找新的预测因素,以期进一步提高模型的精确性并为进一步研究中耳胆脂瘤的发病机制及病程进展提供新的切入点。方法:慢性化脓性中耳炎患者的切口处的外耳道皮肤作为对照组。术中显微镜下观察听骨,并根据Maresh等[10]的分级策略,将中耳胆脂瘤患者的胆脂瘤上皮进一步分组:A组（听骨链正常组）、B组（听骨链部分破坏组）、C组（听骨链完全破坏组,含镫骨上结构缺如者）。HE染色确定组织成分。取对照组15例外耳道皮肤、A组1 1例、B组13例、C组12例的胆脂瘤上皮组织制作石蜡块、并行HE染色、免疫组化染色,并进行阳性评分。每组各取4例行Western-Blot（WB）免疫印迹检测,明确骨膜蛋白在蛋白水平的表达情况。取15例对照组外耳道皮肤、A组13例、B组15例、C组16例胆脂瘤上皮组织行荧光定量qPCR,观察mRNA水平的表达。结果:1.免疫组化结果显示,在外耳道皮肤中,骨膜蛋白主要表达在表皮与真皮交界处,以及毛囊、腺体的外周部位;在胆脂瘤上皮中,骨膜蛋白主要表达于上皮的基底层中,上皮下的结缔组织中也有表达。对照组阳性评分:1.13335±0.33995,听骨链正常组评分1.18180±0.38570,听骨链部分破坏组评分2.00000±0.67935,听骨链完全破坏组（镫骨上结构缺如）.评分2.08335±0.85940。对照组与听骨链正常组P＞0.05,无统计学差异,但对照组与听骨链部分破坏组之间、对照组与听骨链完全破坏组（镫骨上结构缺如）之间比较,P均＜0.05,差异有统计学意义,听骨链部分破坏组与听骨链完全破坏组（镫骨上结构缺如）之间P＞0.05,差异无统计学意义。2.WB和荧光定量qPCR结果显示对照组与听骨链正常组在蛋白水平和mRNA水平表达相比P＞0.05,差异无统计学意义;听骨链部分破坏组与听骨链完全破坏组（镫骨上结构缺如）P＞0.05,差异无统计学意义;但对照组与听骨链部分破坏组之间、对照组与听骨链完全破坏组（镫骨上结构缺如）之间P均＜0.05,差异有统计学意义;听骨链完整组与听骨链部分破坏组之间、听骨链完整组与听骨链完全破坏组之间P＜0.05,差异有统计学意义。结论:1.骨膜蛋白在中耳胆脂瘤上皮中表达,且在听骨链受破坏的胆脂瘤上皮组织中表达更强。2.骨膜蛋白在不同听骨链破坏程度的胆脂瘤上皮中表达不尽相同,可作为预测中耳胆脂瘤患者听力恢复的一个预测指标,进一步提高预测模型的精确性。3.骨膜蛋白参与中耳胆脂瘤的慢性炎症过程,为进一步研究中耳胆脂瘤的发生和进展提供新的方向。