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1.背景与目的:鼻咽癌（NPC）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的一种,好发于我国南方。EBV感染、吸烟、家庭被动吸烟和空气污染及进食富含亚硝胺盐的腌制食物、饮酒、口腔健康和口腔微生物、遗传易感性等都是鼻咽癌的病因,这些因素通过调节肿瘤相关基因的表达在鼻咽癌的发生发展中发挥作用。探索鼻咽癌底层发病机理及寻找有效的分子治疗靶点的研究是目前鼻咽癌领域中最为活跃的前沿研究热点和难点之一。NAP1L1是核小体组装蛋白1-Like-1,是核小体组装蛋白家族的成员,它参与DNA复制、调节染色质形成、促进细胞生长。在过去的研究中,NAP1L1被认为是一种潜在的肿瘤启动子,这一观点已被现在的研究证实。NAP1L1参与了各种癌症的发病机制,包括结直肠癌、肾癌、肝癌、胰腺神经内分泌肿瘤等。然而,NAP1L1在鼻咽癌中的作用和分子机制尚未见报道。本研究团队在GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库和 The Human Protein Atlas数据库中发现,在基因和蛋白水平上,NAP1L1均在头颈部鳞癌中升高,而鼻咽癌是最常见的头颈部鳞癌。我们检测并分析NAP1L1在鼻咽癌中组织标本中高表达,是鼻咽癌独立危险因素,与不良预后相关,这与数据库中结果一致。随后我们从体内外证实NAP1L1作为促癌因子能促进鼻咽癌的增殖;在进一步的机制研究中,我们发现NAP1L1能通过HDGF/c-JUN/CCND1信号轴促进鼻咽癌G1期转化,从而促进鼻咽癌的增殖。我们的研究初步揭示NAP1L1在鼻咽癌中的作用和分子基础,为临床上鼻咽癌治疗寻找有效的分子靶点提供了新思路。2.研究内容和方法:2.1生物信息学分析在 GEPIA 及 THE HUMAN PROTEIN ATLAS DATABASE 数据库分析中发现在头颈部鳞癌中癌组织中的NAP1L1表达明显高于正常组织中的NAP1L1表达。在BioGRID里寻找NAP1L1的相互作用蛋白包括HDGF,MYC,FBXW7等,为后续实验提供思路。2.2NAP1L1在鼻咽癌中高表达,是鼻咽癌预后不良因素,敲低NAP1L1抑制鼻咽癌增殖。2.2.1选取161例鼻咽癌组织（其中包含57对癌和癌旁组织）,免疫组化发现NAP1L1在鼻咽癌组织中高表达,癌旁组织中低表达。生存分析表明NAP1L1过度表达是降低鼻咽癌患者总生存时间的不利因素。2.2.2构建shRNA-NAP1L1及siRNA-NAP1L1鼻咽癌细胞株,WB及qPCR验证效率后,进行细胞学功能实验:MTT、EDU、平板克隆等,证实敲低NAP1L1抑制鼻咽癌细胞的增殖;用shRNA-NAP1L1鼻咽癌细胞株进行细胞周期实验,发现shRNA-NAP1L1鼻咽癌细胞株阻滞在G1期,用shRNA-NAP1L1鼻咽癌细胞株进行裸鼠皮下成瘤,体内实验进一步证实敲低NAP1L1抑制鼻咽癌细胞增殖。2.3全转录组基因测序用稳定敲低NAP1L1（shRNA-NAP1L1）的鼻咽癌细胞株进行全转录组基因测序,收集到差异基因表达,在差异基因表达基础上,用GSEA高级分析发现敲低NAP1L1的鼻咽癌细胞株在细胞分化、激活和生长中受到抑制,增殖相关的显著性差异基因有CCND1和E2F1。进一步用qPCR和WB进一步验证,CCND1、CDK4、E2F1在稳定敲低NAP1L1的鼻咽癌细胞株中下调。2.4NAP1L1 与 HDGF 相互作用,招募 c-JUN,刺激 CCND1、CDK4、E2F1 促进鼻咽癌细胞的增殖2.4.1 NAP1L1与HDGF相互作用:根据数据库分析结果,免疫共沉淀实验证实NAP1L1与HDGF相互结合。免疫荧光发现NAP1L1和HDGF相互结合部位主要在鼻咽癌细胞胞浆内。2.4.2 HDGF与c-JUN相互作用:免疫共沉淀实验分析显示c-JUN与HDGF在鼻咽癌细胞株中存在相互结合。免疫荧光发现HDGF和c-JUN相互结合部位主要在鼻咽癌细胞胞浆内。2.4.3在稳定敲低NAP1L1（shRNA-NAP1L1）的鼻咽癌细胞中回复HDGF质粒,首先qPCR和WesternBlot验证转染效率,明确转染效率后,WesternBlot结果验证回复HDGF后c-JUN,CCND1,CDK4,E2F1蛋白表达明显增加,且逆转shRNA-NAP1L1抑制的鼻咽癌细胞增殖。2.4.4在稳定敲低NAP1L1（shRNA-NAP1L1）鼻咽癌细胞中回复c-JUN质粒,首先qPCR和WesternBlot验证转染效率,明确转染效率后,WesternBlot结果显示CCND1,CDK4,E2F1蛋白表达明显增加,且逆转shRNA-NAP1L1抑制的鼻咽癌细胞增殖。2.5 敲低 HDGF（siHDGF）后,鼻咽癌细胞中的 c-JUN/CCND1/CDK4/E2F1 表达降低,但是NAP1L1无改变,NAP1L1-cDNA质粒转染siHDGF鼻咽癌细胞,使其恢复了细胞增殖的能力。3.结论:3.1 NAP1L1蛋白在鼻咽癌组织中表达明显高于正常鼻咽上皮组织,NAP1L1过表达是鼻咽癌临床进展和生存期短、预后不良的不利因素。3.2敲低NAP1L1抑制鼻咽癌细胞的增殖。3.3全转录组基因测序及GSEA分析提示敲低NAP1L1使鼻咽癌细胞株在细胞激活、分化和生长中受到显著抑制,增殖显著相关的差异基因有CCND1和E2F1。3.4NAP1L1与HDGF相互作用,后者与c-JUN相互作用,最终诱导细胞周期启动子CCND1/CDK4/E2F1的表达,促进鼻咽癌细胞G1期转化,从而诱导鼻咽癌细胞的生长。