【摘 要】
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黑水虻幼虫的生活环境中充满病原菌,其有效的防御机制成为研究热点。黑水虻抗菌肽的热稳定性好、抗菌谱广、不易产生耐药性,是开发新型抗生素替代物和饲料添加剂较有前景的来源之一。本文对黑水虻幼虫进行食源性诱导使其产生抗菌肽,成功从黑水虻幼虫中获得了具有抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的活性组分,主要研究结果如下.(1)本文通过溶剂法和血淋巴提取法收集幼虫抗菌肽粗提物,两种方法均能有效提取出具有抑菌活性
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黑水虻幼虫的生活环境中充满病原菌,其有效的防御机制成为研究热点。黑水虻抗菌肽的热稳定性好、抗菌谱广、不易产生耐药性,是开发新型抗生素替代物和饲料添加剂较有前景的来源之一。本文对黑水虻幼虫进行食源性诱导使其产生抗菌肽,成功从黑水虻幼虫中获得了具有抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的活性组分,主要研究结果如下.(1)本文通过溶剂法和血淋巴提取法收集幼虫抗菌肽粗提物,两种方法均能有效提取出具有抑菌活性的抗菌成分。诱导条件优化结果表明,诱导组抑菌效果强于非诱导组。植物油、混合菌液诱导5龄幼虫诱产生的抗菌肽显示出最强的抑菌活性,采用滤纸片法测得其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为20.20 mm、18.10 mm。采用液体培养抑制法对细菌做抑菌持续时间分析,结果显示诱导组抗菌肽均能显著抑制细菌生长,而非诱导组细菌生长曲线与细菌正常生长曲线趋势相同,接种5 h后进入对数生长期。打孔法测定抑菌当量,结果表明20μL 100 mg/m L的抗菌肽对细菌的抑菌效果相对于等量的0.3 mg/m L庆大霉素。最小抑菌浓度结果表明,抗菌肽在特定浓度下表现出显著的抑制微生物生长能力,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRAS)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌最小抑菌浓度为5 mg/m L、沙门氏菌最小抑菌浓度为2.5 mg/m L。本研究表明黑水虻抗菌肽抗菌谱较广,对不同种类和不同状态下生长的微生物具有不同的抑菌效果。(2)对抗菌肽进行的分离纯化与鉴定。在最佳诱导条件下提取的抗菌肽通过超滤后抑菌活性增强。Tricine-SDS-PAGE电泳检测诱导后幼虫抗菌肽的存在,结果表明抗菌肽的组成中存在分子量5 k D左右的小肽。HPLC分析,结果表明样品各组分分离度较好。C18固相萃取进行分离,得到不同的活性组分,滤纸片法测定抑菌活性,结果表明20%乙腈洗脱组分对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌的抑制效果较好,其中对沙门氏菌的抑菌活性最强,在10%、20%、50%乙腈洗脱组分中均观察到抑菌区域,抑菌圈直径分别7.50 mm、9.75 mm、10 mm。洗脱组分对酵母菌和黑曲霉均有抑菌活性,抑菌直径分别为7.25 mm、9.05 mm。对活性较强的抗菌肽组分进行表征,LC-MS质谱结果得到3种具有抑菌活性的小分子活性成分。MALDI-TOF-MS质谱结果显示抗菌肽分子量为4242.231 Da,推测其为防御素类抗菌肽。
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