【摘 要】
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水平基因转移是生物进化的重要途径之一,目前已作为成熟工具被应用于生物底盘改造、重要天然产物的异源表达等。链霉菌可产生丰富的天然产物,常被用作异源表达宿主。接合转移是水平基因转移的方式之一。目前一些有重要价值的非模式链霉菌接合转移效率较低,无法顺利进行遗传改造,因此需要对接合转移过程进行进一步探究和优化。植物凝集素是一种糖蛋白,可以与细菌表面的糖基特异性结合,从而修饰在细菌表面。本研究利用植物凝集素
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水平基因转移是生物进化的重要途径之一,目前已作为成熟工具被应用于生物底盘改造、重要天然产物的异源表达等。链霉菌可产生丰富的天然产物,常被用作异源表达宿主。接合转移是水平基因转移的方式之一。目前一些有重要价值的非模式链霉菌接合转移效率较低,无法顺利进行遗传改造,因此需要对接合转移过程进行进一步探究和优化。植物凝集素是一种糖蛋白,可以与细菌表面的糖基特异性结合,从而修饰在细菌表面。本研究利用植物凝集素将DNA链引入到细菌表面,通过DNA链的配对引导细菌的粘附聚集,构建了大肠杆菌与链霉菌的组装方法,从而为探究大肠杆菌与链霉菌的水平基因转移过程提供新的研究策略。本课题主要研究结果有:（1）成功构建了4株表达红色荧光的大肠杆菌,2株表达绿色荧光的链霉菌和1株表达蓝色荧光的链霉菌。用于测试接合转移效率的红色荧光质粒为6583 bp,基因片段为711 bp。（2）测试得到一组接合转移效率较稳定的模式菌:供体大肠杆菌ET12567和受体天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3（2）,接合转移效率可稳定在10-4左右。（3）探究了供体与受体用量以及植物凝集素修饰细菌表面对接合转移的影响。结果表明,孢子用量的改变会导致接合效率呈现规律性变化。孢子用量为1×10~4时接合转移效率最高,为（5.3±0.5）×10-4。孢子用量为1×10~4时接合转移效率为零。植物凝集素修饰大肠杆菌和链霉菌表面对接合转移无显著抑制作用。（4）应用植物凝集素将互补DNA单链分别引入大肠杆菌与链霉菌表面。荧光显微镜表征表明,DNA链能够介导大肠杆菌与链霉菌孢子的聚集,且随着细菌表面植物凝集素-DNA共轭物浓度的增大,细菌的聚集程度增加。10倍理论最大量植物凝集素-DNA共轭物（1.5×10~6个Con A-DNA修饰一个大肠杆菌,6.3×10~6个WGA-DNA修饰一个链霉菌孢子）介导的接合转移效率最高,为（3.3±0.5）×10-4。本研究验证了植物凝集素修饰细菌表面不会对接合转移产生明显的抑制作用。后续引入的8 bp DNA链能够有效介导大肠杆菌与链霉菌孢子的组装聚集,证明我们成功构建了一种实现革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌组装的方法。本方法为控制大肠杆菌和链霉菌在接合转移过程中的距离提供了新手段,后续可通过调整DNA链长度以及细菌表面的DNA链数量,对接合转移过程进行进一步探究,为提高接合转移效率提供新工具和新信息。
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