前列腺癌作为危害男性健康的主要癌症之一,其发病率仅次于肺癌。虽然其发病率有明显的地理和种族差异,如加勒比海及斯堪的纳维亚地区、美国黑人前列腺癌发病率为全世界最高;但目前,在中国、日本及原苏联等发病率相对较低的区域,随着人们生活习惯的改变及经济发展带来的全球化进展的加速,此发病率也在逐年上升,不容忽视。前列腺癌的治疗难度不亚于其他任何一种癌症。其肿瘤可通过穿透包膜进入精囊外周的软组织,或经射精管侵犯精囊。随着肿瘤细胞转移能力及恶化程度的增强,部分相关基因的表达及存在形式出现异常,其表达或上调或受抑制,也存在基因发生突变或缺失。有研究发现,TNS4(又名Cten,是一种张力蛋白)的分布具有组织特异性,在胚胎和正常前列腺组织中有着较高的表达量,而在多数其他组织中则相反。近年来,一些研究开始关注TNS4与前列腺癌的关系。发现前列腺癌细胞中TNS4的表达极低,甚至个别前列腺癌细胞株中已很难检测到TNS4的表达。这预示着TNS4与肿瘤进展可能有着密切的联系。但是TNS4在前列腺癌中的作用仍没有弄清楚,有关TNS4在前列腺癌细胞中表达受抑制或缺失的分子机制也尚不清楚。因此,本课题通过研究TNS4在前列腺癌细胞中的表达情况、存在形式及其与细胞生长、细胞凋亡、细胞周期之间的相互作用,了解TNS4对前列腺癌细胞PC-3的迁移、粘附、侵袭能力,生长的影响以及TNS4在前列腺癌肿瘤发生发展中的作用。由此,实验内容主要分为以下几个部分:首先选择 BPH1、WPMY-1、LNCaP、CRW22Rv1、DU145、PC-3 六种比较经典的前列腺(癌)细胞,使用RT-PCR对TNS4进行mRNA水平进行检测,发现TNS4在前列腺增生细胞BPH1中表达较高,在癌变的细胞中则相反;其中在恶化程度较高的PC-3细胞中的表达水平很难检测到。然后,将BPH1、LNCaP、DU145、PC-3四种细胞中获得的TNS4完整CDS序列(cDNA序列)进行测序,发现只有BPH1细胞与NCBI提供的人正常前列腺组织中TNS4的CDS序列一致,而LNCaP、DU145、PC-3细胞均发生了不同程度的突变,其中LNCaP和DU145细胞在相同的位点发生了同样的两处单碱基突变,第426位T突变为C,第1454位G突变为A;PC-3细胞的变化程度最大,除了与LNCaP和DU145细胞相同的两处突变外,还发生了第876位碱基的缺失。使用Primer Premier5.0将测序获得的各组CDS碱基序列翻译成氨基酸序列后进行比对,发现LNCaP和DU145细胞的两处单碱基突变中第426位处导致氨基酸从丝氨酸变化为脯氨酸,此氨基酸的变化发生在TNS4常被磷酸化区域,应对其功能会有较大的影响;而PC-3细胞由于碱基的缺失,氨基酸序列自第291位发生改变。接下来,以DU145细胞获得CDS为模板,联合单点突变技术,构建突变型TNS4全长质粒TNS4-Mut和野生型TNS4全长质粒TNS4-WT。经蛋白免疫印迹实验证实质粒构建成功。最后,利用细胞功能实验来检测TNS4发生突变对自身功能的影响,以及分析TNS4-WT和TNS4-Mut两种类型的TNS4对细胞功能影响上的差异。一方面,我们通过MTT实验发现,分别过表达野生型和突变型TNS4后,PC-3细胞增殖速度减慢;另一方面,同样过表达TNS4-WT和TNS4-Mut后通过流式进行周期分析,结果显示二者均能够增加G2期细胞数目,证实TNS4能够抑制细胞周期进程。细胞流式分析凋亡结果发现,TNS4并未影响细胞的凋亡。同时,我们在前列腺癌细胞PC-3中分别过表达TNS4-WT和TNS4-Mut后,通过细胞的划痕、粘附实验以及Transwell实验,发现野生型TNS4和突变型TNS4均可以促进PC-3细胞的迁移能力、侵袭能力,削弱其粘附能力,但在影响程度上突变型TNS4更为显著。说明TNS4在前列腺癌中既有抑制细胞增殖、阻滞细胞周期进程的抑癌功能;又有促进细胞迁移、侵袭,削弱其粘附能力等的促癌功能,且TNS4-WT和TNS4-Mut组表现出差异。此外,我们发现过表达TNS4对STAT1的表达、入核等行为有较显著的影响。PC-3 细胞分别转染 TNS4-WT 和 TNS4-Mut 后,RT-PCR、Western Blot 检测发现 STAT1的转录和翻译水平均明显上升;免疫荧光技术检测到TNS4-Mut可以很大程度上促进STAT1的入核。说明TNS4可能通过STAT1途径来影响前列腺癌细胞的增殖、迁移、粘附和侵袭等。综上所述,本研究证实TNS4在不同的前列腺癌细胞中发生了不同程度的突变。野生型和突变型TNS4均对细胞的增殖及周期有所抑制,发挥着抑癌功能;同时可以削弱细胞的粘附能力、增强其迁移和侵袭能力,发挥着促癌功能,而且两种不同形式的TNS4在影响程度上表现出差异。这些可能是通过STAT1相关的信号途径来实现的。多烯紫杉醇(Docetaxel)是以紫杉树中的化学物质为基础而合成的有效抗癌药物,在乳腺癌和非小细胞癌的治疗中已广泛应用,前列腺癌的临床治疗中也有效地用到了多烯紫杉醇。有研究报道,多烯紫杉醇可以明显降低前列腺癌细胞的存活能力,具有诱人的前列腺癌治疗应用前景。本研究中,首先采用不同浓度及作用时间,用多烯紫杉醇刺激前列腺癌细胞,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹实验(Westernblot)分别检测前列腺癌细胞PC-3和LNCaP中Smad3的表达变化,发现无论是在mRNA水平还是蛋白水平,多烯紫杉醇都可以有效的降低Smad3的表达。然后用TGF-P1与多烯紫杉醇共同刺激PC-3细胞,测定Smad3的蛋白及磷酸化水平的变化。发现,多烯紫杉醇会抑制PC-3细胞中Smad3的表达,而TGF-(31可以减弱这一抑制作用,磷酸化水平的Smad3也是如此。由此总结,多烯紫杉醇可能通过TGF-pl/Smads非依赖和依赖型途径来抑制Smad3的表达。另外,通过co-IP实验检测到STAT1与Smad3存在互作关系,STAT1在Smad3的启动子上有多个结合位点,而且多烯紫杉醇同样可以下调STAT1的表达,这一发现证实了多烯紫杉醇可能通过TGF-pl/Smads非依赖型途径下调Smad3的表达。综上所述,多烯紫杉醇通过不同方式抑制Smad3的表达达到抑癌效果。