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目的通过观察吡非尼酮对体外培养的兔眼Tenons囊成纤维细胞(RTFs)增殖的抑制作用,探讨其可能的发生机制,为今后吡非尼酮应用于青光眼术后滤过区抗瘢痕化的实验研究提供分子生物学依据。方法1、RTFs的体外培养和鉴定:取兔眼Tenons囊组织,采用简化的组织块培养法,进行兔眼Tenons囊成纤维细胞体外培养,利用显微镜、免疫组化法进行细胞形态观察和细胞鉴定;2、采用CCK-8法检测与对照组(只含有细胞和培养液的未加药组)相比较,不同浓度吡非尼酮(0.01、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、1mg/ml)作用24小时后RTFs的吸光度值(A值)变化情况,初步确定吡非尼酮的起始作用浓度;3、再次采用CCK-8法检测与对照组(只含有细胞和培养液的未加药组)相比较,不同浓度的吡非尼酮(0.5、1、1.5、2、2.5mg/ml组;1、1.2、1.5、1.6、1.8、2mg/ml组)作用24小时后RTFs的A值变化情况,进一步确定吡非尼酮的起始作用浓度和药物最大无毒浓度;4、采用免疫荧光法检测不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用后24小时后,RTFs中TGF-β1、TGF-β2及Smad3的表达情况;5、通过Western blot法检测不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用24小时后TGF-β1、TGF-β2及Smad3蛋白表达变化;6、通过RT-PCR法检测不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用24小时后TGF-β1、TGF-β2及Smad3基因表达的变化,由此探讨吡非尼酮抑制RTFs增殖可能的机制。结果1、成功体外培养RTFs,细胞大部分呈长梭形,胞核较大,胞浆丰富,细胞生长速度快,在空间充足的情况下呈旋涡状或放射状生长;RTFs波形蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,可以判断所培养细胞为成纤维细胞而非结膜细胞或上皮细胞;2、采用CCK-8法检测不同浓度吡非尼酮(0.01、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、1mg/ml)作用于RTFs 24小时后的吸光度(A值),结果表明实验组(0.01、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5mg/ml)与对照组相比较无统计学差异(P>0.05),而实验组(1mg/ml)与对照组相比较有统计学差异(P<0.05),初步证实1mg/ml可能是吡非尼酮抑制RTFs增殖的起始作用浓度;3、为确定吡非尼酮的起始作用浓度并筛选药物最大无毒浓度,进一步采用CCK-8法检测不同浓度吡非尼酮(0.5、1、1.5、2、2.5mg/ml)作用于RTFs24小时后的A值,结果表明实验组(0.5mg/ml)与对照组相比较无统计学差异(P<0.05),实验组(1、1.5、2、2.5mg/ml)与对照组相比较均有统计学差异(P<0.05),其中2mg/ml与2.5mg/ml组细胞存活率分别为0.32051和0.07692,细胞存活率低于50%,对细胞具有毒性作用,因此1.5mg/ml可能为吡非尼酮的药物最大无毒浓度。为进一步确定吡非尼酮的药物最大无毒浓度,再次采用CCK-8法检测不同浓度吡非尼酮(1、1.2、1.5、1.6、1.8、2mg/ml)作用于RTFs24小时后的A值,结果表明各实验组与对照组相比较均有统计学差异(P<0.05),而1.8mg/ml与2mg/ml组的细胞存活率分别为0.46429和0.45238,细胞存活率低于50%。因此确定吡非尼酮抑制RTFs增殖的起始作用浓度和药物最大无毒浓度分别为1mg/ml和1.6mg/ml。4、免疫荧光实验结果显示,不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用24小时后,与对照组相比,实验组RTFs中TGF-β1、TGF-β2及Smad3表达均减少(P<0.05),且随着药物浓度增加,吡非尼酮抑制作用增强;5、Western blot实验结果显示,不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用后,与对照组相比,实验组的TGF-β1、TGF-β2及Smad3的蛋白表达量均减少(P<0.05),且随着药物浓度增加,其抑制作用增强;6、RT-PCR结果显示,不同浓度吡非尼酮(1、1.6mg/ml)作用后,与对照组相比,实验组的TGF-β1、TGF-β2及Smad3的基因相对表达量均减少(P<0.05),且随着药物浓度增加,其抑制作用增强。结论(1)吡非尼酮对体外培养的RTFs增殖有明显的抑制作用,1mg/ml和1.6mg/ml分别为吡非尼酮抑制RTFs增殖的起始作用浓度和药物最大无毒浓度;(2)吡非尼酮抑制RTFs增殖的可能机制是:通过影响TGF-β/Smad通路上的重要因子和效应蛋白TGF-β1、TGF-β2、Smad3的蛋白和基因表达,进而发挥抑制RTFs增殖的作用。