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一、课题背景胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,其侵袭性及增殖能力较强,具有高发病率、高术后复发率、高病死率及低治愈率的特点,是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。并且,恶性胶质瘤难以通过手术根治且对放化疗普遍不敏感,同时,现有的恶性胶质瘤放射增敏剂普遍存在着增敏效果差、毒副作用大等缺陷,且其放射增敏效果仍然存在争议,难以满足临床上胶质瘤放射增敏的需求。因此,寻找恶性胶质瘤放射增敏的新靶点,进一步提高恶性胶质瘤的放疗效果,具有十分重要的临床意义。在肿瘤放疗领域的研究中,放疗抵抗的产生机制尚未完全清楚,高效的放射增敏新基因的研究亟待加强。近年来,随着肿瘤生物学和放射肿瘤学的发展,针对肿瘤放射敏感性相关基因的靶向治疗成为研究热点,而全基因组筛选文库有望从人类全基因组的角度筛选出更高效的肿瘤放射增敏靶点。CRISPR Cas9技术是近年来发展迅速的一项基因编辑技术,在此基础上构建的CRISPR Cas9人类全基因组文库为筛选肿瘤放射增敏新靶点提供了新的方法。本研究中,我们使用CRISPR Cas9人类全基因组文库感染了恶性人脑胶质瘤细胞,并通过高通量测序阴性筛选的方法,发现了放射增敏新靶点TTC9C,并进一步在细胞学、动物学、临床层面验证了其放射增敏效果,并对其影响放射敏感性的分子机制进行了深入探究。二、研究内容及方法1、CRISPR Cas9全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点本研究首先使用文库感染U87MG细胞后,给予γ射线照射处理,之后使用阴性筛选策略,通过高通量测序获得差异基因作为候选。接下来,使用不同组织来源的肿瘤细胞系构建候选基因的敲低细胞系,进一步通过克隆形成率、细胞凋亡、DNA损伤修复通路检测等手段验证候选靶基因的放射增敏效果,并从中选出了放射增敏效果最佳的靶基因TTC9C。2、TTC9C对胶质瘤细胞放射敏感性的调控作用研究选取不同来源背景的胶质瘤细胞系,构建其TTC9C敲除、过表达稳转细胞,通过肿瘤细胞的增殖、迁移、克隆形成率、凋亡、周期、免疫荧光、DNA损伤修复通路检测等方式,进一步明确其放射增敏效果,并初步探索TTC9C对DNA损伤修复的影响。3、TTC9C对颅内胶质瘤放射敏感性的影响及临床研究构建裸鼠颅内胶质瘤放疗模型,通过生存率观察、脑组织解剖、病理切片、免疫组化等方式,进一步明确了TTC9C敲除在颅内胶质瘤中的放射增敏效果,并验证其对HR修复通路的抑制作用。接下来,通过生物信息学分析等手段,进一步探究了TTC9C在胶质瘤等肿瘤中的表达特征、与HR修复蛋白的共表达关系等,进一步明确TTC9C的生物学作用与功能。4、TTC9C对胶质瘤放射敏感性的调控机制研究本研究使用DSBs foci的方法,检测TTC9C照后于DSBs断端的募集情况,判断其是否直接募集于DNA断端直接发挥作用。接下来,通过免疫共沉淀与Western Blot,检测照后TTC9C是否发生了相应的蛋白分子修饰。进一步通过IP质谱明确TTC9C的互作蛋白与DNA损伤修复的关系,进而通过Co-IP与Western Blot的方法明确其直接作用的分子为ATR。接下来,通过构建ATR的不同截断体,明确TTC9C与ATR结合的具体功能域。三、研究结果:本研究主要结果如下:1、在人类全基因组范围内,成功筛选出了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C:（1）使用CRISPR Cas9人类全基因组文库成功感染了人脑胶质瘤细胞U87MG;（2）通过高通量二代测序及文献调研等方法选取了TTC9C等5个候选基因;（3）验证了5个候选基因的放射增敏效果,确定TTC9C为目标靶基因。2、体外实验中,TTC9C敲除在胶质瘤细胞中发挥了显著的放射增敏效应:（1）TTC9C敲除显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力;（2）TTC9C敲除显著减弱胶质瘤细胞的迁移能力;（3）TTC9C敲除显著降低胶质瘤细胞的照后活力;（4）TTC9C敲除显著减少胶质瘤细胞的照后存活率;（5）TTC9C敲除显著促进胶质瘤细胞的照后凋亡;（6）TTC9C敲除显著抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复;（7）TTC9C敲除显著抑制照后DNA损伤修复通路的激活。3、体内实验中,TTC9C敲低在颅内胶质瘤放疗中发挥了显著的放射增敏作用,进一步研究显示,TTC9C在包括胶质瘤在内的多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用:（1）TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显著的放射增敏效果,显著延长荷瘤裸鼠的照后生存时间、减小颅内胶质瘤的照后体积、抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力、促进颅内胶质瘤的照后凋亡、抑制颅内胶质瘤的照后HR修复;（2）TTC9C与胶质瘤患者预后和HR修复信号通路密切相关,TTC9C表达量显著影响胶质瘤等癌症患者的预后、TTC9C与HR相关蛋白的表达具有显著的相关性。4、TTC9C与ATR结合,直接参与了照后DNA损伤的HR修复:（1）电离辐射可导致TTC9C核内募集;（2）TTC9C在照后发生磷酸化修饰;（3）TTC9C与ATR等HR修复通路相关蛋白结合发挥作用;（5）TTC9C与ATR的N端结合。五、结论:本研究通过CRISPR Cas9全基因组文库筛选发现了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C,并在细胞和动物模型中明确了其放射增敏作用。机制研究发现,TTC9C通过与ATR结合,参与电离辐射导致的DNA损伤的HR修复,从而影响人脑胶质瘤的放射敏感性。我们的结果提示,TTC9C在人脑胶质瘤细胞放疗中具有巨大的潜在应用价值。