前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,近年来,随着中国人口老龄化的加剧和生活习惯的变化,中国男性前列腺癌发病率持续升高,对男性健康构成了严重威胁,给医疗带来了巨大压力。雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy,ADT）是前列腺癌的重要治疗手段,大多数患者接受治疗初期具有良好的反应性,但是随着治疗时间的延长,绝大多数患者发展成为ADT抵抗的去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer,CRPC）。目前,针对CRPC开发出了选择性更强的雄激素受体拮抗剂恩扎卢胺（Enzalutamide,MDV3100）等新型雄激素受体拮抗剂,然而在短时间内即可出现耐药的现象,CRPC获得较治疗前更强的ADT抵抗能力,表现为Advanced CRPC,最终导致恩扎卢胺治疗失败。目前,关于ADT抵抗的研究主要围绕雄激素受体（AR,androgen receptor）相关信号通路以及AR受体的突变等方面。而对ADT药物治疗所引起前列腺癌组织本身的细胞生物学变化在ADT抵抗发生过程中的作用没有受到充分的关注。我们前期的研究注意到恩扎卢胺等ADT药物治疗能够引起前列腺癌细胞出现明显的细胞衰老（senescence）现象以及衰老相关分泌表型（SASP,senescence-associated secretory phenotype）的改变;SASP因子具有广泛的生物学功能,参与到组织干细胞活化等多种病理生理过程。而肿瘤干细胞理论认为肿瘤的生长由少量肿瘤干细胞或肿瘤干细胞样细胞（CSC,cancer stem cell-like cell）推动,其具有与正常干细胞某些类似的性质,参与到肿瘤发生、发展的多个环节。前列腺癌中同样存在前列腺癌干细胞样细胞（PCSC,prostate cancer stem cell-like cell）这一类具有干细胞特性的前列腺癌细胞亚群,其表达CD44等表面分子,参与前列腺癌的发生、耐药等过程。传统理论认为PCSC在ADT治疗过程中是因“被动”选择而富集的,认为是ADT抵抗发生的可能原因之一;而PCSC不表达或者低表达AR,故对ADT治疗无直接响应的生物学基础。基于上述研究结论,本课题推测在前列腺癌的恩扎卢胺过程中,恩扎卢胺可诱导前列腺癌细胞发生细胞衰老及SASP因子的分泌,将显著改变前列腺癌组织的微环境状态,微环境变化的过程伴随着恩扎卢胺耐药的发生,而PCSC在前列腺癌ADT抵抗等过程中处于重要的地位,那么恩扎卢胺治疗过程中PCSC的生物学性质是否会发生改变,发生何种变化,其生物学性质的变化是否参与到恩扎卢胺耐药的发生等系列问题有待研究和探讨。第一部分:恩扎卢胺具有诱导雄激素受体AR阳性前列腺癌LNCa P细胞发生细胞衰老的作用恩扎卢胺处理AR阳性前列腺癌LNCa P细胞,发现恩扎卢胺可以显著抑制LNCa P细胞的增殖。表达谱测序分析结果显示,恩扎卢胺可以显著抑制LNCa P细胞有丝分裂、细胞周期等多条参与细胞增殖过程的生物学过程及信号通路。进一步实验证实,恩扎卢胺处理AR阳性前列腺癌LNCa P细胞后,细胞衰老相关半乳糖苷酶SA-β-gal活性的显著升高,P21、P16等细胞衰老相关基因的表达水平升高,同时伴随着DNA损伤标志物γH2AX的表达增强。这些实验结果均表明恩扎卢胺可以诱导LNCa P细胞出现明显的细胞衰老。细胞衰老伴随着明显的SASP分泌特征,PCSC作为参与前列腺癌发生、耐药的关键细胞亚群,具有对恩扎卢胺诱导的SASP做出反应的生物学基础,进一步探讨其是否会在恩扎卢胺诱导前列腺癌细胞衰老过程中出现生物学性质的转换将为后续研究提供方向。第二部分:恩扎卢胺诱发CD44high前列腺癌干细胞样细胞的活化CSC表现出活跃的生物学性质和可塑性,为肿瘤的耐药、复发等过程提供生物学基础。在衰老相关的研究中发现,多种组织干细胞在器官发生衰老的早期会被激活,更新组织中因发生细胞衰老而损失的细胞,以维持器官的正常功能,这一过程由SASP所驱动。在恩扎卢胺处理过程中,前列腺癌发生显著的细胞衰老,那么在前列腺癌细胞衰老发生的过程中是否出现PCSC生物学性状的改变?为了解答这一问题,本部分将进一步探索此过程中PCSC自我更新等生物学性质的变化。本部分研究发现恩扎卢胺处理后的LNCa P细胞具有更强的悬浮成球能力,并且Oct4、Sox2等干性维持转录因子的表达水平升高,表现出细胞群体干性增强的现象。细胞表面分子CD44阳性前列腺癌细胞具有更强的自我更新和成瘤能力,在鉴别和分离PCSC中被广泛应用。本研究观察到恩扎卢胺可上调LNCa P细胞CD44high细胞亚群的比例,并可诱导CD44lowLNCa P细胞凋亡,CD44highPCSC则表现出抵抗凋亡的能力,表现出被动选择性的比例增高。进一步对CD44highPCSC的自我更新能力进行分析,发现恩扎卢胺处理过程中伴随着CD44highPCSC增殖能力的增强及细胞增殖核抗原Ki67的表达水平的增高,同时DNA损伤标志物γH2AX的表达水平出现下降的趋势;恩扎卢胺处理下CD44highPCSC的表达谱测序分析结果显示,有丝分裂、Ras信号通路等出现活化,表明恩扎卢胺治疗过程中伴随着CD44highPCSC自我更新能力的增强,PCSC具有“主动”响应恩扎卢胺的性质。同时,本研究还发现恩扎卢胺处理过程中CD44highPCSC中细胞衰老相关基因P16、P21等表达水平较CD44lowLNCa P细胞亚群更低,表现出更为“年轻”的状态。本部分研究表明恩扎卢胺处理过程中出现CD44highPCSC活化、自我更新能力增强的现象,表现出主动响应的恩扎卢胺生物学性质,而AR低表达的CD44highPCSC对恩扎卢胺不具备直接反应的分子基础,这提示恩扎卢胺诱导SASP因子介导的微环境变化可能是活化CD44highPCSC的因素之一,有待后续研究的开展。第三部分:恩扎卢胺诱导的前列腺癌衰老相关分泌蛋白CCL5参与CD44highPCSC的活化及相关机制SASP因子分泌是细胞衰老的特有现象,是细胞衰老发挥生物学功能的重要媒介。恩扎卢胺可诱导前列腺癌细胞出现明显的细胞衰老,同时伴随着CD44highPCSC的活化。本部分将分析恩扎卢胺诱导SASP因子分泌特征,筛选出参与CD44highPCSC活化的关键SASP因子。首先利用蛋白质芯片技术对恩扎卢胺诱导前列腺癌SASP因子的特征进行分析,发现处理后的LNCa P细胞中CCL5、CCL20、CCL8等趋化因子浓度出现显著升高,而肝细胞生长因子HGF、总前列腺腺特异性PSA等因子则出现显著降低。通过筛选,发现CCL5因子可增强LNCa P细胞群体干性维持基因表达,并提高CD44highPCSC细胞比例和增殖能力的作用;这些作用可被CCL5因子受体CCR5抑制剂马拉维若所削弱,提示CCL5因子在活化PCSC过程中可能发挥作用。同时,对CCL5因子诱导CD44highPCSC的表达谱变化特征进行分析,结果显示CCL5可以活化其MAPK信号通路。MAPK信号参与干细胞细胞增殖等过程的调控。这些研究现象均表明,CCL5因子在活化CD44highPCSC细胞过程中发挥作用。恩扎卢胺处理及CCL5因子诱导均可活化CD44highPCSC细胞Ras信号通路和MAPK信号通路,两者均涉及下游MEK/ERK信号通路的活化;同时有研究表明CCR5介导的信号可参与ERK信号通路的活化,提示ERK信号在CCL5活化CD44highPCSC中可能发挥作用。进一步通过研究证明,恩扎卢胺处理可以诱导ERK信号中ERK、MEK分子表达水平增高,CCL5因子可增强ERK及MEK的磷酸化,其磷酸化可被CCR5拮抗剂所拮抗。MEK/ERK信号参与干细胞自我更新、分化、有丝分裂等过程,提示CCL5介导的ERK信号通路在恩扎卢胺处理过程中CD44highPCSC细胞的活化发挥关键作用。第四部分:CCR5抑制剂马拉维若联合恩扎卢胺协同抑制小鼠前列腺癌模型肿瘤生长前列腺癌患者接受恩扎卢胺治疗后,会在短时间内发生更强的ADT抵抗,出现恩扎卢胺的耐药,开发延缓恩扎卢胺耐药的方法对改善患者预后有一定意义。前述研究表明,恩扎卢胺诱导SASP因子CCL5因子可通过CCR5受体介导的ERK信号通路活化PCSC,可能参与恩扎卢胺耐药的发生。基于上述结论,本部分研究将对CCR5拮抗剂马拉维若联合恩扎卢胺对前列腺癌的协同治疗能力进行分析。首先利用Chou-Talalay数学模型发现马拉维若与恩扎卢胺在抑制体外培养LNCa P细胞增殖方面表现出强协同作用。应用前列腺癌NOD/SCID小鼠皮下荷瘤模型发现,马拉维若联合应用可以进一步降低恩扎卢胺治疗小鼠的荷瘤质量,并且降低CD44、Sox2等干性标志物基因的表达水平;同时,还能抑制MEK、ERK分子的磷酸化水平,表现出降低皮下荷瘤前列腺癌干细胞性质的作用。本部分研究表明马拉维若、恩扎卢胺在前列腺癌的治疗中具有协同作用,马拉维若可能通过抑制恩扎卢胺诱导CCL5因子对PCSC的活化而发挥药效,这为开发延长恩扎卢胺有效治疗时间窗口的方法提供了候选的方法。综上所述,本论文提出了恩扎卢胺诱导的前列腺癌SASP因子CCL5可通过CCR5受体介导的ERK信号通路活化CD44highPCSC参与恩扎卢胺耐药的新观点,丰富了目前对于恩扎卢胺等ADT药物抵抗发生机制的理解,为延缓恩扎卢胺耐药治疗方法的开发提供了可能的新方向。