Brassica carinata×Brassica napus杂交后代遗传变异及白粉病抗性分析

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油菜白粉病危害日趋严重,甘蓝型油菜(Brassica napus)是目前我国油菜的主栽品种,但其对白粉病抗性较弱;在埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)SAO TOME中发现一株开白花的植株,对白粉病近免疫,通过远缘杂交可将埃芥良好白粉病抗性基因导入甘蓝型油菜。本文利用远缘杂交后代遗传多态性分析、病原菌及叶片细胞学观察、抗病基因定量PCR检测、转录组差异表达基因筛选等方法,对甘蓝型油菜与埃芥远缘杂交后代进行遗传变异研究及油菜对白粉抗病性的特征研究。结果表明:1、利用化学杀雄剂诱导雄蕊败育,促进母本Brassica carinata异交,获得与甘蓝型油菜优良品种中双11远缘杂交的种子。利用形态特征、种子质量和分子标记对杂交植株和回交后代进行了验证,BC1F3代中的5个品系,命名为W7-1、W7-4、W7-6、W8-1和W8-3,和一个BC2F2品系W3PS-1鉴定为对白粉病具有抗性或中度抗性。大多数抗病/中抗后代的形态性状(叶形、花瓣颜色、表皮蜡质、角果长度)和种子品质与甘蓝型油菜亲本中双11相似,表明抗病基因已成功导入甘蓝型油菜。2、观察了油菜白粉病侵染叶片的细胞学过程,对接种白粉病的远缘杂交后代抗、感病株系叶片进行了生理生化特征比较:(1)通过表皮蜡质观察及蜡质提取称重,发现针状形态的蜡质及较多的蜡质含量对叶片抗白粉病侵入有一定的帮助;(2)观察叶片横切面的石蜡切片,结果显示抗性材料具有致密整齐的栅栏组织和较为规则的海绵组织,该特点可能有利于叶片对抗白粉病菌侵染;(3)叶片胼胝质观察及测定结果表明,在接菌后不同时期,抗病叶片中胼胝质荧光斑点的分布均低于感病品种,而且在接种白粉病菌两周后,抗病品种叶片胼胝质积累量明显低于感病品种,两种胼胝质合成酶编码基因Cal S5及Cal S12的相对表达量趋势以及表达量在感、抗材料中均有所不同。3、在甘蓝型油菜的数据库筛选得到负调控白粉病抗性的霉菌座位(Mildew locus O)Bn Mlo家族成员相关信息,构建系统进化树,明确了Bn Mlo基因及蛋白的结构模式,检测了Bn Mlo2、Bn Mlo6与Bn Mlo12在抗、感白粉病油菜中的表达趋势。4、对白粉病侵染处理后发病盛期的感(S)、抗(R)叶片做了转录组学比较,共鉴定出465个抗病反应相关途径的差异表达基因(DETs),其中303个R组叶片比S组叶片表达量高,162个表达量低。这些DETs主要集中在表皮防御、脂质代谢、R蛋白、受体蛋白激酶及调控因子方面,其中在R组叶片中表达量较高主要有:编码与蜡质、叶绿体、细胞壁代谢相关的蛋白和酶如KCS6、CSP41B、RWA、胼胝质合酶3、果胶酶9、果糖苷酶2、9S-脂氧合酶LOX2等;编码蛋白激酶有RKL、ERECTA、BAK1、BAM2、Lys M受体样激酶、脂质转移蛋白激酶ERL1、ERL2等,它们识别病原体并触发PTI免疫;白粉病广谱抗性蛋白RPW8、钙调蛋白MLO2、PMR5以及MLP328、EDR2、RPS4和RPS6等。在S组中表达量较多的如果胶酯酶、细胞色素CYP81F2、13S-脂氧合酶;富含半胱氨酸的受体蛋白激酶、Ser/Thr蛋白激酶如丝裂原活化蛋白激酶,还有RLK6、CRK45、APK1、BRL3、WAK1、WAK10等;TIR-NB-LRR类受体蛋白RLM1、DSC1、DSC2、病程相关蛋白RP-1等,某些抗病基因的个别拷贝在S组叶片中表达量高于抗病叶片,如MLO2、EDR2、EDR4,类RPW8蛋白HR3等的编码基因;E3泛素转移酶、ATP水解酶、RLP23、NPR3、NPR4、解毒蛋白(EDS5)、WRKY转录因子家族如WRKY53、WRKY70等的编码基因在S材料中表达量均高于R材料。根据这些证据,初步构建了油菜对白粉病抗性反应转录组变化模式图。本文研究结果为种间远缘杂交改良油菜品种适应性积累了技术资料,为油菜抗白粉病育种提供了依据,初步揭示了与抗白粉病菌入侵表达相关的细胞活动与防御反应遗传调控机制。
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