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两栖动物在生物进化史上是一种由水生向陆生过度的关键物种,其幼体阶段完全营水生生活（胚胎期及幼体变态前期）,经变态过程（变态期）后转变为陆生生活的蛙类（成体期）。由于两栖动物生活史的特殊性,使得它们对外界环境的变化非常敏感,因此可以将其作为监测环境变化的指示生物。近几十年来,大量研究报道了两栖动物种群丰富度及多样性急剧下降,甚至濒临灭绝。造成该现象的主要原因可以归结为气候变化、外来物种入侵及栖息地污染等。随着城镇化和工业化进程的加快,环境污染所造成的两栖动物栖息地的减少已然成为了两栖动物所面临的最严峻问题之一。重金属离子具有难以降解以及在生物体内无法被代谢排出等特性,因此成为一种对生物体极其有害的环境污染物。随着人们生活以及工业污水排放,其在环境中的浓度不断增加,且在许多污染严重的地区,重金属离子的浓度已经超过了阈值,这严重威胁到了所有水生生物的正常生理代谢和种群繁衍。在众多的重金属离子中,镉（Cadmium,Cd）和铅（Lead,Pb）是两种主要的危害水生生物健康的有害离子。据报道在河流、河口和近岸水域的Cd和Pb含量呈现逐年上升趋势,且Cd和Pb以共存的形式存在于环境中。然而,目前有关于Cd和Pb对两栖动物危害的研究主要集中于单一的Cd或Pb暴露,因此对于混合离子的研究就变得尤为重要。据此,本研究利用中华大蟾蜍（Bufo gargarizans,是一种广泛分布于中国,且产卵量巨大的两栖动物）作为研究对象,选取胚胎期（Gs16-Gs22期）,前变态期（Gs38期）,变态高峰期（Gs42期）以及变态完成期（Gs46期）三个具有代表性的时期,通过检测形态学,基因表达,肠道菌群及骨骼生长发育的变化,来探究混合Cd（1μM）,Pb（1μM）及Cd-Pb混合（1μM Cd+1μM Pb）胁迫后中华大蟾蜍机体的毒理响应机制,并获得到以下研究结果:1.在中华大蟾蜍胚胎发育早期（Gs16-Gs22期）,利用形态学检测,qPCR技术等,探究对氧化应激、凋亡、炎症及免疫相关基因的响应及Cd/Pb暴露（单一及混合）对中华大蟾蜍胚胎发育的影响。结果表明,相比于单个Cd或Pb,Cd-Pb引起了更显著的基因响应（one-way ANOVA,P＜0.05）,如 SOD,GPx,SOCS3,IL-27等。此外,本研究还观察到,在Gs19期,Cd,Pb及Cd-Pb混合处理组中分别观察到4.8%,0.65%和10.3%的胚胎畸形率。因此,与单个金属暴露相比,混合处理加剧了胚胎畸形,且更能引起胚胎的氧化应激及免疫系统响应。2.在Gs38期,分别从宿主和微生物两个方面进行分析,得到如结果:1)分别采用石蜡切片法、紫外分光光度法、qRT-PCR法及16S rRNA V3-V4片段高通量测序法分析Cd/Pb暴露后对Gs38期蝌蚪的肠道组织学、消化酶（脂肪酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）活性、氧化应激、凋亡和免疫相关基因应答以及肠道菌群的影响。结果表明,Cd-Pb混合处理之后中华大蟾蜍的生长发育延缓,形态学参数（体重、体长、肠长和肠重）显著降低（one-way ANOVA,P＜0.05）,H＆E染色法及Masson三色染色法对组织的分析结果显示,Cd-Pb混合处理组后肠道上皮细胞高度显著减小（one-way ANOVA,P＜0.05）,上皮细胞边界模糊退化,且出现细胞核皱缩等较为严重的组织学损伤;消化酶活性结果表明,Cd-Pb混合处理组中所测定的四种消化酶活性均显著降低（one-way ANOVA,P＜0.05）;qPCR结果显示,这些重金属离子暴露造成了肠道的氧化应激基因表达的显著下降（one-way ANOVA,P＜0.05）,引起肠道中免疫相关基因的显著上调（one-way ANOVA,P＜0.05）。2)肠道菌群结果分析表明,本实验发现Cd/Pb（单独及混合）暴露均改变了肠道菌群的丰富度和多样性,造成了处理组与对照组之间菌群结构的显著差异（Bray-Curtis,P＜0.05）。此外,重金属离子引起组成肠道菌群的细菌生态位发生改变,具体表现为变形菌门（Proteobacteria）的群落丰度显著上升（one-way ANOVA,P＜0.05）,该菌群被认为是菌群内部最不稳定的菌门;相关性分析表明,“宿主因子”与一些菌门（如梭杆菌门）的改变呈显著正相关,而与一些菌门（变形菌门,厚壁菌门）显著负相关（one-way ANOVA,P＜0.05）;PICRUSt和Tax4Fun预测结果表明,混合暴露使菌群中与代谢及免疫系统功能的KEGG通路丰度显著上升（one-way ANOVA,P＜0.05）,增加了免疫疾病发生的风险。3.1)在Gs42-Gs46期,通过Masson三色染色法,阿利新兰-茜素红骨骼双染色技术和Illumina转录组测序等技术,探究Cd和Pb暴露对中华大蟾蜍变态高峰期（Gs42期）蝌蚪甲状腺发育、四肢软骨内骨化过程的影响以及对变态完成期（Gs46期）成体中华大蟾蜍骨骼发育及行为学的影响。研究结果表明:长期的Cd-Pb混合暴露会引起幼体变态的提前,变态时体型缩小,持续时间显著缩短（one-way ANOVA,P＜0.05）;甲状腺组织学结果显示,Cd-Pb混合处理组甲状腺处于活跃状态,主要表现为甲状腺面积增大及吞噬泡显著增多（one-way ANOVA,P＜0.05）;然而,加速变态引起骨骼生长发育的缺陷,本研究发现多种骨骼的骨化程度显著降低,有些甚至不足50%（one-way ANOVA,P＜0.05）。全身转录组测序结果显示,处理组中显著上调的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）主要富集为“补体系统”（complement and coagulation cascades）,其参与一种慢性软骨病的发生。2)在Gs46期,形态学结果表明,混合暴露后成体的变态速度加快但个体显著缩小,而单一金属离子暴露后成体的变态速度减慢但个体显著增大（one-way ANOVA,P＜0.05）;骨骼染色结果显示,骨化率依然显著低于对照组（one-way ANOVA,P＜0.05）,成体最高骨化率仅达85.93%。最后,本研究发现Cd-Pb混合暴露导致一些与甲状腺激素相关基因（如TRα,Dio2,Dio3等）和骨骼发育相关基因（如 MMP9,Runx3）在 mRNA 水平上显著下调（one-way ANOVA,P＜0.05）。综上所述,本研究通过对中华大蟾蜍个体生长阶段进行长期的重金属离子水体暴露,运用了多种生物学检测技术,测定不同发育时期的生长指标。这些结果表明胚胎早期暴露于外源污染物可能会影响中华大蟾蜍后期的生理机能,如肠道稳态的失调、骨骼发育损伤以及运动能力的受损。这些生命活动的正常进行对机体觅食、抵御天敌等行为均发挥着非常重要的作用。本研究对环境保护特别是水环境的保护及检测提供了重要的实验参考和理论依据,唤起社会大众对Cd和Pb等重金属离子污染的重视,对社会公众环保意识的提高和推动具有积极的现实意义。也对两栖动物种群的生物多样性保护和安全可持续发展具有帮助意义。