论文部分内容阅读
过氧乙酸是一种重要的化工原料。传统的化学合成法,存在易爆、产品质量不稳定等诸多缺陷,发展酶法催化合成工艺是实现安全生产的重要途径之一。过水解催化活性目前普遍认为是α/β水解酶折叠家族酶蛋白在进化过程中保留下来的催化活性,属于该族酶蛋白的多功能催化活性（Promiscuous activity）。发现和挖掘具有过水解催化活性的酶蛋白,对发展绿色合成过氧乙酸工艺,具有积极意义。通过调研已有的专利和文献报道,发现芽胞杆菌产生的多种α/β水解酶折叠家族酶蛋白,包括Bacillus subtilis源蛋白酶（subtilisin Carlsberg,SCP）,Bacillus pumilus源乙酰木聚糖酯酶（Acetyl xylan esterase,AXE）和Bacillus subtilis源头孢菌素C乙酰水解酶（Cephalosporin acetyl hydrolase,CAH）等,均表现出较好的过水解催化活性。在此基础上,本论文主要开展了下面三个方面的工作:（1）从特定生境中筛选芽胞杆菌;（2）从分离到的B.subtilis NSYT-3和B.pumilus OSLJ-13菌株中分别克隆scp、cah和axe基因,并进行异源表达;（3）分离纯化上述重组蛋白,测定其过水解催化活性的酶学常数,并尝试建立与葡萄糖氧化酶的串联催化反应。具体结果如下:1、从全国8个地区（福州永泰,临汾洪洞,青岛莱西,许昌鄢陵,天水甘谷,新乡长垣,福州连江和漳州平和）采集了24份19种植物根系土壤样本以及从市场购买5种纳豆产品,经过初筛,获得85株产蛋白酶的芽胞杆菌。PCR扩增上述芽胞杆菌菌株的16S rDNA基因片段,并利用HhaⅠ、MspⅠ和RsaⅠ三种限制性内切酶进行限制性片段多态性分析（Restriction fragment length polymorphism,RFLP）。RFLP分析结果表明:上述85株芽胞杆菌一共分为12个类群。从上述每个类群中,分别挑选出产蛋白酶酶活高的一个或两个菌株,测定其16S r DNA基因片段序列,并进行聚类分析。聚类分析结果表明:本次实验获得的芽胞杆菌主要集中在Bacillus subtilis,Bacillus cereus,Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。2、从B.subtilis NSYT-3菌株克隆的CAH蛋白编码基因序列全长957 bp,编码318个氨基酸;从B.pumilus OSLJ-13菌株克隆的AXE蛋白编码基因序列全长963bp,编码320个氨基酸;从B.subtilis NSYT-3菌株克隆的SCP蛋白编码基因全长1146bp,编码381个氨基酸。SCP重组蛋白多肽链由三部分组成:信号肽29个氨基酸,前导肽77个氨基酸和成熟肽为275个氨基酸。模拟获得的上述三种蛋白的3D结构均符合α/β水解酶折叠家族酶蛋白结构。将上述三种α/β水解酶折叠家族酶蛋白编码基因克隆到表达载体p ET 28a上,然后导入到E.coli BL21（DE3）菌株中进行异源表达、镍柱纯化和SDS-PAGE分析。实验结果表明:重组AXE,CAH和SCP的相对分子量分别为35.90 kDa,35.60 kDa和29 kDa;纯化倍数分别为1.30倍、7.60倍和6倍;酶活回收率分别为57.30%、46.50%和31%。其中重组AXE和CAH表现出过水解酶活,其比活力分别为0.90 U/mg和2.00 U/mg。3、重组AXE过水解催化活性的酶学动力学参数Km、Vmax和kcat/Km分别为:112.60 mmol·L-1、10.40μmol·mg-1·min-1和3.50×103min-1;重组CAH过水解催化活性的酶学动力学参数Km、Vmax和kcat/Km分别为76.80 mmol·L-1、22.20μmol·mg-1·min-1和1.60×103min-1。4、将耻垢分枝杆菌酰基转移酶（Mycobacterium smegmatis Acyl transferase,Ms Ac T）、AXE、CAH和滨海嗜热菌乙酰木聚糖酯酶（Tmermotoga maritima cetyl xylan esterase,Tm AXE）四种过水解酶（Ms Ac T和Tm AXE由本课题组其他同学纯化制备）分别与葡萄糖氧化酶偶联,动力学分析结果显示:GOD-Ms Ac T、GOD-AXE、GOD-CAH和GOD-Tm AXE偶联体系转化0.14μmol的2-氯-5,5-二乙基-1,3-环己二酮（Monochlorodimedone,MCD）分别需要2.50 h、4.70 h、4.30 h和4.70 h。随后对每20 min（或每8 min）MCD的转化速率进行分析,结果表明:随着过氧化氢的积累,反应速率也随之增大,GOD-Ms Ac T、GOD-AXE、GOD-CAH和GOD-Tm AXE偶联体系中,对MCD最大转化速率分别为34.70μmol/L/h、15.30μmol/L/h、18.00μmol/L/h和17.00μmol/L/h。