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猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度传染性和严重的肠道疾病，2010年以前，PED在我国各地呈现零星散发，猪群的发病率和致死率很低，2010年底，PEDV新型变异株出现，中国的许多猪场都暴发了严重的PED，其对猪群的高发病率及高死亡率，尤其感染仔猪的致死率高达100％，造成了巨大的经济损失。2011年底，伪狂犬病毒(PRV)变异株的出现了也给伪狂犬病(PR)的净化带来了新的挑战。有研究发现，以PRV作为活载体表达其它病毒的抗原表位区，可以达到一免多防的目的。PEDV和PRV的经典疫苗均不能对当前的流毒行株提供完全保护，因此，针对当前的PEDV和PRV流行变异株的新型疫苗亟待开发。
PEDV的中和表位主要位于S1基因上，已经证实在PEDVS蛋白表面存在4个主要的中和表位区(aa499-638、748-755、764-771和1368-1374)，CS区(aa499-789)包含S蛋白前三个主要中和表位。为了获得表达PEDV中和表位区CS的重组PRV病毒，本试验将PEDVCS表位区进行克隆，并通过BamHⅠ酶切位点插入到PRV转移质粒pEG中，得到重组转移质粒pEG-CS。该质粒包含伪狂犬病毒gG基因两端的序列作为左右同源臂，然后与rPRVNY-gE/gI-/TK毒株转染至猪睾丸(ST)细胞发生同源重组，经蚀斑纯化先得到带绿色荧光标签的重组病毒rPRV-CS-EGFP+，再利用CRISPR/Cas9敲除系统(PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP)将用于筛选的荧光标签(EGFP)基因去除，成功获得重组病毒rPRV-CS。经PCR检测表明CS区成功插入到PRV的基因组中，RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示中和表位区CS能够转录与表达。
白细胞介素6(IL6)是一种多功能细胞因子，可以刺激T细胞的增殖、活化和B细胞的分化来参与适应性免疫，IL6广泛用于疫苗佐剂、肿瘤辅助治疗、疾病诊断等领域研究，具有良好的应用前景。为了获得同时表达PEDV中和表位区CS和猪IL6的重组PRV病毒，并探究IL6作为免疫佐剂的效应。本试验从猪血液中提取总RNA，扩增猪IL6基因，然后引物两端加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，将其插入到哺乳动物真核表达质粒pBApo-EF1α_Pur_DNA中，同时在IL6序列前引入KozaK序列(GCCACC)，增强IL6蛋白的表达。再用高保真酶从该载体上扩增IL6表达盒，并通过Bstz17I酶切位点插入到重组转移质粒pEG-CS中，得到重组转移质粒pEG-CS-IL6，与rPRVNY-gE-/gI-/TK-毒株发生同源重组，经蚀斑纯化重组病毒rPRV-CS-IL6-EGFP+，再将EGFP荧光标签敲除，成功获得重组病毒rPRV-CS-IL6。经PCR检测表明CS表位区和IL6表达盒成功插入到PRV的基因组中，RT-PCR、Western-blot和间按免疫荧光试验结果显示中和表位区CS表位区抗原和IL6都能够转录与表达。
本试验在ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、IPEC细胞上对重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的生长特性、TCID50、遗传稳定性，以及在小鼠体内的安全性、免疫效力进行试验。结果显示，重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6在ST细胞上测定的TCID50结果分别为106.5/0.1mL，106.875/0.1mL，表明ST细胞更适合重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的增殖培养。重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的生长特性均与亲本株rPRVNY-gE-/gI-/TK病毒滴度增长趋势相似，连续传代20代，未发生碱基突变、缺失、插入，表明重组病毒的遗传稳定性较好。rPRV-CS和rPRV-CS-IL6对小鼠安全，可诱导小鼠产生针对PRV和PEDV的特异性免疫应答，能够保护小鼠免于PRV强毒致死性攻击。另外，重组病毒rPRV-CS-IL6组产生的抗体水平高于重组病毒rPRV-CS组，表明IL6细胞因子具有一定的增强免疫作用，可以作为疫苗佐剂。
综上，本研究以rPRVNY-gE-/gI-/TK-毒株作亲本株，成功拯救山两株重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6，并探究了其生物学特性和在小鼠体内的免疫效力，这为下一步在猪只上进行相关的免疫研究奠定一定的基础。重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6有望成为防治PEDV和PRV的二联弱毒疫苗候选株，为有效防控PEDV和PRV提供有力工具，也为基因工程活载体疫苗的研发奠定了理论和技术支持。
PEDV的中和表位主要位于S1基因上，已经证实在PEDVS蛋白表面存在4个主要的中和表位区(aa499-638、748-755、764-771和1368-1374)，CS区(aa499-789)包含S蛋白前三个主要中和表位。为了获得表达PEDV中和表位区CS的重组PRV病毒，本试验将PEDVCS表位区进行克隆，并通过BamHⅠ酶切位点插入到PRV转移质粒pEG中，得到重组转移质粒pEG-CS。该质粒包含伪狂犬病毒gG基因两端的序列作为左右同源臂，然后与rPRVNY-gE/gI-/TK毒株转染至猪睾丸(ST)细胞发生同源重组，经蚀斑纯化先得到带绿色荧光标签的重组病毒rPRV-CS-EGFP+，再利用CRISPR/Cas9敲除系统(PX459-gRNA1-EZ-gRNA3-EGFP)将用于筛选的荧光标签(EGFP)基因去除，成功获得重组病毒rPRV-CS。经PCR检测表明CS区成功插入到PRV的基因组中，RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示中和表位区CS能够转录与表达。
白细胞介素6(IL6)是一种多功能细胞因子，可以刺激T细胞的增殖、活化和B细胞的分化来参与适应性免疫，IL6广泛用于疫苗佐剂、肿瘤辅助治疗、疾病诊断等领域研究，具有良好的应用前景。为了获得同时表达PEDV中和表位区CS和猪IL6的重组PRV病毒，并探究IL6作为免疫佐剂的效应。本试验从猪血液中提取总RNA，扩增猪IL6基因，然后引物两端加BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，将其插入到哺乳动物真核表达质粒pBApo-EF1α_Pur_DNA中，同时在IL6序列前引入KozaK序列(GCCACC)，增强IL6蛋白的表达。再用高保真酶从该载体上扩增IL6表达盒，并通过Bstz17I酶切位点插入到重组转移质粒pEG-CS中，得到重组转移质粒pEG-CS-IL6，与rPRVNY-gE-/gI-/TK-毒株发生同源重组，经蚀斑纯化重组病毒rPRV-CS-IL6-EGFP+，再将EGFP荧光标签敲除，成功获得重组病毒rPRV-CS-IL6。经PCR检测表明CS表位区和IL6表达盒成功插入到PRV的基因组中，RT-PCR、Western-blot和间按免疫荧光试验结果显示中和表位区CS表位区抗原和IL6都能够转录与表达。
本试验在ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、IPEC细胞上对重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的生长特性、TCID50、遗传稳定性，以及在小鼠体内的安全性、免疫效力进行试验。结果显示，重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6在ST细胞上测定的TCID50结果分别为106.5/0.1mL，106.875/0.1mL，表明ST细胞更适合重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的增殖培养。重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6的生长特性均与亲本株rPRVNY-gE-/gI-/TK病毒滴度增长趋势相似，连续传代20代，未发生碱基突变、缺失、插入，表明重组病毒的遗传稳定性较好。rPRV-CS和rPRV-CS-IL6对小鼠安全，可诱导小鼠产生针对PRV和PEDV的特异性免疫应答，能够保护小鼠免于PRV强毒致死性攻击。另外，重组病毒rPRV-CS-IL6组产生的抗体水平高于重组病毒rPRV-CS组，表明IL6细胞因子具有一定的增强免疫作用，可以作为疫苗佐剂。
综上，本研究以rPRVNY-gE-/gI-/TK-毒株作亲本株，成功拯救山两株重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6，并探究了其生物学特性和在小鼠体内的免疫效力，这为下一步在猪只上进行相关的免疫研究奠定一定的基础。重组病毒rPRV-CS和rPRV-CS-IL6有望成为防治PEDV和PRV的二联弱毒疫苗候选株，为有效防控PEDV和PRV提供有力工具，也为基因工程活载体疫苗的研发奠定了理论和技术支持。