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T-2毒素（T-2 toxin,T-2）是一种强毒性单端孢霉A型化合物,调查显示其在谷物和畜禽饲料中检出率极高,经食物链传递后会增加人类食品的安全隐患,严重威胁着人畜健康,因此建立一种高效便捷、快速准确的检测技术对控制食品安全至关重要。传统的仪器分析和免疫学分析检测步骤复杂,批量样品检测时间长,实现现场即时检测可能性小。比色生物传感技术由于制备简单、成本较低、分析速度快、可裸眼分析判断,近年来在药物监测、食品安全及环境污染中得到广泛应用。核酸适配体（Aptamer,Apt）因可与筛选靶标特异性结合,被称之为“人工抗体”,体外筛选、易合成和修饰、亲和力强、稳定性好,是生物传感器构建中较理想的分子识别元件之一。但目前针对T-2毒素的Apt筛选序列极少,亲和力小,交叉反应率大,限制了其在生物传感上的广泛应用。本研究运用指数富集配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by EXponetial Enrichment,SELEX）从ssDNA文库序列中筛选鉴定出T-2毒素高特异性和亲和力的核酸适配体,并基于筛选序列进行比色检测技术的构建,建立了肌肉、肝脏、牛奶等动物源性食品和饲料中T-2毒素的快速检测方法,易于肉眼判断检测结果,为食品安全监督提供了新的快速检测思路。1基于GO的非固定SELEX技术筛选T-2毒素核酸适配体序列方法的研究本试验利用非固定氧化石墨烯（Graphene Oxide,GO）-SELEX完成了T-2毒素核酸适配体的筛选鉴定工作。首先选用80bp长度大小（中间40bp的随机核酸序列,两端各20bp固定序列）的单链DNA文库（single-stranded DNA,ssDNA）进行核酸适配体的筛选。基于GO与ssDNA的非特异性吸附力强,与T-2毒素特异性结合的ssDNA复合物吸附力弱原理,进行了13轮的正/反筛选,通过降低投入量、增加反筛选和缩短孵育时间增强了筛选压力以获得特异性更强的核酸适配体系列。初始文库经过加热变性预处理后和筛选靶标进行控温孵育,再加入GO吸附未结合的ssDNA,离心取上清进行PCR扩增、λExonuclease水解获得次级筛选文库,回收率基本稳定后对回收产物进行了单克隆测序,获得了20条不同的ssDNA序列;然后利用MEGA-X进行了序列比对分析,选取了Seq H3-3、Seq H5-2、Seq Q12-1和Seq Q13-2 4条序列进行亲和力分析,其解离常数分别为23.04±8.06 nmol/L、7.49±2.18 nmol/L、74.43±21.79 nmol/L、43.11±17.81 nmol/L;最后根据解离常数越小亲和力越强原则,选用Seq H5-2进行了特异性分析,结果显示筛选得到的Apt序列特异性良好,填充了T-2毒素特异性适配体文库,并为T-2毒素的检测提供了新思路。2基于核酸适配体的金纳米粒子比色法检测T-2毒素本试验使用上述筛选得到的Seq H5-2序列,利用金纳米粒子的局部表面等离子共振特点建立了针对T-2毒素的比色检测方法。首先将与T-2毒素核酸适配体序列部分互补且富含G碱基的探针Probe G序列在高温加热条件下形成杂交双链,检测时毒素可与Apt特异结合释放出Probe G序列,后者与hemin（氯化血红素）结合组装成结构稳定的hemin/G-四链体DNAzyme,具有过氧化物酶催化活性,从而催化氧化H2O2造成检测体系中金纳米粒子的生成减慢,形成不同状态的金纳米粒子,颜色由红转变为蓝,实现了对T-2毒素的可视化分析检测,同时可利用酶标仪测定吸光度实现准确定量分析。试验过程中分别对MES、氯金酸、过氧化氢、hemin浓度以及孵育温度和孵育时间进行了系列优化,得到了最佳检测条件。该方法在1μg/L-100μg/L范围内,OD550nm检测值与T-2毒素浓度之间线性关系较好,y=-0.0005x+0.3846,R~2=0.9908,检测灵敏度为2.22μg/L,可视化临界值为20μg/L。此外,此方法对饲料、猪肉、猪肝和牛奶样品,检测限（LOD）分别是119.80μg/kg、6.36μg/kg、7.27μg/kg、7.36μg/kg,定量限（LOQ）依次为294.80μg/kg、15.81μg/kg、18.39μg/kg、18.77μg/kg。并且向基质中分别添加低中高三种不同浓度T-2毒素后,回收率位于66.67%和96.25%之间,组内组间的变异系数都低于15%,与液质联用技术（LC-MS/MS）对比后,该比色检测方法与液质联用方法相关性良好,相关指数R~2=0.9940,表明该检测分析方法结果可靠。本研究基于非固定GO-SELEX技术,筛选确定了T-2的核酸适配体序列Seq H5-2,并建立了基于Apt的T-2毒素比色方法,可完成饲料和动物源性食品中的快速简便检测,为畜禽养殖和食品安全等领域的现场即时检测提供了一种新方法。